副猪嗜血杆菌鉴定分型方法研究现状

随着养殖水平的提高,近年来,副猪嗜血杆菌(HPS)在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜,已从多个省市地区分离出副猪嗜血杆菌,HPS的血清型复杂,用传统的方法往往不能达到对其快速准确鉴定的目的。大量研究表明不同血清型HPS毒株其毒力和致病力存在差异,因此,找出一种敏感性、特异性与重复性都非常良好的分型方法,对副猪嗜血杆菌病的防控有着重要的意义。     

6株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对福建省一些猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌感染的病例的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16S rRNA并进行测序分析,对分离菌进行细菌形态和PCR鉴定及序列分析。结果显示,获得6株副猪嗜血杆菌分离株,该6株分离株之间的同源性在99%以上,而与国内外参考菌株序列之间的同源性在84.5%-99.2%。发育进化树分析结果表明,分离菌株与血清4型和5型的关系较近,与其他血清型关系较远。     

副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1~H9),并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在分离菌株中得到了相应的表达。这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。     

副猪嗜血杆菌分离株的耐药性及耐药基因分析

为了解浙江省规模化猪场患病猪副猪嗜血杆菌的耐药性,采用K-B琼脂法对73株HPS浙江株进行了18种临床药物的敏感性试验,同时应用PCR技术对11个相关耐药基因进行扩增、测序和比对分析。药敏试验结果显示：对磺胺类耐药的分离株比例高达86．30％,对四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类和氯霉素类耐药的比例分别为65．75％,60．27％,50．68％,50．68％,46．58％,对大环内酯类耐药仅为28．77％。 PCR分析显示：97．26％的菌株中检测到耐药基因,多重耐药的占84．93％。其中喹诺酮类耐药基因Aac（6′）-1b的检出率为76．71％,氨基糖苷类耐药基因AadA1的检出率为65．75％,磺胺类耐药基因Sul1和Sul2的检出率为45．2％和10．96％,氯霉素类耐药基因Flor、CmLA、Cat1的检出率为15．07％,8．22％,58．9％,四环素类耐药基因 TetA和 TetB 的检出率为4．11％和49.32％,β-内酰胺类耐药基因Tem-11的检出率为35．62％,大环内酯类耐药基因ErmB的检出率为1．37％。耐药基因型和表型符合率为：磺胺类62．07％,β-内酰胺类74．29％,氯霉素类81．48％,四环素类75.00％,大环内酯类0,喹诺酮类75．68％,氨基糖苷类72．09％。因此,HPS在浙江规模化猪场对临床药物已产生了耐药性,通过耐药基因检测结果确定耐药菌株具有一定的参考价值。     

副猪嗜血杆菌不同分离株CDT基因序列测定及其遗传变异分析

CDT毒素是多种革兰氏阴性致病菌的毒力因子.为了阐明CDT毒素在副猪嗜血杆菌不同菌株中的分布及其遗传变异情况,本试验对从浙江省不同地区猪场临床发病猪中分离到的41个副猪嗜血杆菌分离株进行了CDT基因PCR扩增,并对其中21个分离株CDT 3个亚基进行了基因测序及氨基酸序列分析.结果表明:所有41个临床分离株中都可以检测...     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5基因的克隆和表达

副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis)是规模化猪场的重要细菌性疾病之一。对已发表的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子量大约为41 kDa,利用基因工程的方法将该基因片段定向克隆至表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达后的分子量约为67 kDa。该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌病的防治

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的一种世界范围内流行的重要疾病。由于我国的饲养管理条件较差，该病流行和危害日渐严重，应引起广大养殖户足够的重视。一、流行情况副猪嗜血杆菌只感染猪，主要存在于猪的上呼吸道（鼻腔、扁桃体和气管前段等）内，通过猪群间的接触和空气飞沫以及污染物而传播，带菌猪和慢性感染猪为本病的传染源。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白 P5的分段表达及免疫学性质分析

为获得副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的分段表达产物,并对各片段的免疫学性质进行鉴定。采用生物信息学软件分析Omp P5全长基因,设计3对分段引物,PCR分别从HPS汕头分离株（H0801）Omp P5中扩增出P5F1、P5F2和P5F3基因片段,构建于pET-32a（＋）原核表达载体上,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。将蛋白纯化后,利用ELISA及Western Blot分别鉴定其免疫原性及抗原性。结果表明,扩增得到的Omp P5的3个基因片段与预期大小相符合,基因测序结果与GenBank 公布的序列一致,经SDS-PAGE分析,3个蛋白表达相对分子质量大小都与预期相符。 ELISA和Western Blot分析显示,表达的3个蛋白表现出良好的抗原性和免疫原性。 HPS Omp P5的分段表达为进一步研究HPS保护性表位及疫苗鉴定奠定了新的基础。     

应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因

为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。     

基于重组外膜蛋白P2的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立

旨在建立一种基于重组副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白(Omp) P2的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.将重组表达的Omp P2纯化后作为ELISA包被抗原,建立了一种基于重组P2蛋白的间接ELISA方法,并对此方法的反应条件进行了优化.确定ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/mL,被检血清1∶8...     

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断液的制备

【目的】建立一种便于检测副猪嗜血杆菌抗体的方法。【方法】将分离纯化的副猪嗜血杆菌5型超声裂解后,致敏双醛处理的健康绵羊红细胞,制成副猪嗜血杆菌5型间接血凝诊断液,检测该诊断液的活力及特异性。【结果】该诊断液特异性强,仅与副猪嗜血杆菌5型阳性血清发生凝集反应。活力也比较高,达到1:512以上,可以用其进行副猪嗜血杆菌疫苗免疫后抗体检测。【结论】该间接血凝诊断液成功制备为广大兽医化验人员提供一种简单、快速、经济的检测副猪嗜血杆菌抗体的方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断和防治提供一种有效的手段     

副猪嗜血杆菌中毒素蛋白基因hipA的生物信息学分析

为预测毒素蛋白HipA的二级结构和B细胞抗原表位,首先从GenBank中查找副猪嗜血杆菌毒素蛋白基因hipA的序列,应用生物信息学方法,对副猪嗜血杆菌毒素蛋白HipA的理化性质、二级结构和B细胞抗原表位进行预测。结果显示,HipA蛋白的理论等电点为7.23,前50个氨基酸为信号肽,二级结构的预测结果显示该酶主要以α螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,只有少数的β转角;推测该蛋白有17个B细胞优势抗原表位区域。该研究为进一步研究分析副猪嗜血杆菌毒素蛋白HipA的功能奠定理论基础。     

副猪嗜血杆菌高免血清的制备与应用

利用华中农业大学蔡旭旺博士分离鉴定的副猪嗜血杆菌作为标准菌株培养灭活后,两次免疫家兔后,耳静脉攻毒,心脏采血,琼扩试验检测抗体效价,抗体在1:8以上颈静脉放血,分离血清,用于琼扩试验检测本室从河南省发病猪场分离鉴定的副猪嗜血杆菌的血清型,所分离的33株菌中有12株4型,9株5型,6株13型,3株14型,2株12型,1株2型,未分出其它血清型。结果表明河南省副猪嗜血杆菌主要以4型、5型和13型为主要流行的血清型。     

福建省猪流行性腹泻流行病学调查

为探求2012-2013年猪流行性腹泻病毒（PEDV）在福建省的流行情况,本研究采用RT-PCR方法对采自福建省125个规模猪场的257份发生腹泻病料进行PED病原检测,并分析PEDV致猪群的发病情况。结果：被检病料PEDV的阳性率为63.04%（162/257）,能导致不同阶段猪群发病,尤其是对哺乳仔猪的发病率最严重,死亡率高达100%。表明：PEDV在我省发病仍较为严重,应加强防控,以减少损失。     

青海省西宁地区绵羊住肉孢子虫感染情况调查研究

为了掌握青海省西宁市及其辖属区县绵羊住肉孢子虫的感染强度并明确感染类型。通过随机采集供往西宁市辖属区县各市场、超市及摊贩的屠宰后绵羊不同部位肌肉组织,进行压片镜检、染色切片观察和形态学鉴定;选取虫体含量高的羊心肌和膈肌样品,提取基因组DNA以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(Cox1)基因设计引物进行PCR扩增并测序比对。西宁市辖属区县绵羊住肉孢子虫感染率为82.5%,平均感染强度7.67,从寄生部位上看,膈肌感染率最高(75%),其次是心肌(67.5%)、舌肌(57.5%),食道肌未见有感染。所检虫体边缘肌肉组织较疏松,虫体囊壁分为两层,原生囊壁与次生囊壁均结构平整无突起皱褶等特殊性结构,经PCR扩增出长度为905 bp的目标片段,测序后在GenBank上进行序列比对,其与已公布的羊柔嫩住肉孢子虫的同源性达98%,最终鉴定为羊柔嫩住肉孢子虫。初步明确青海西宁地区绵羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子虫(Sarcocystis tenella)为主,且西宁市感染率高于中国绵羊住肉孢子虫感染的平均水平。建议加强青海省西宁地区羊住肉孢子虫实验室检测及调运、屠宰检验检疫力度,保证上市羊肉类产品卫生质量,保障公众的身体健康和饮食安全。     

河南省兔球虫感染情况及种类调查研究

为了掌握河南省兔球虫感染情况,用麦克马斯特虫卵计数法和饱和氯化钠溶液漂浮法对来自河南省不同地区的11个兔场共465份新鲜粪便进行兔球虫感染情况调查和球虫种类形态鉴定。结果发现：兔球虫平均感染率为74.6%,多数为混合感染,感染球虫种类多在4~6种,以1—3月龄幼兔感染率最高,达83.0%,并且感染强度OPG值最高,平均为6.8×104。本次共检出11种艾美耳球虫,其中大型艾美耳球虫、无残艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫、肠艾美耳球虫为优势种。本实验结果为进一步有效控制兔球虫病和筛选兔球虫疫苗提供重要的参考依据。     

山东省规模化奶牛场结核病与副结核病流行病学调查研究

近年来,随着中国奶业的快速发展,奶牛结核与副结核病越来越严重地威胁到行业的健康发展,牛结核与副结核病的防控也日益受到重视。缺乏牛结核与副结核病流行病学数据及有效的疫苗是中国控制牛结核与副结核病的最大障碍。由此本试验利用牛型提纯结核菌素、提纯副结核菌素对牛群进行皮内变态反应试验,筛选出阳性牛和可疑牛,以进一步开展γ-干扰素释放试验,从而对山东省规模化奶牛场逐步开展分子流行病学调查。2010-2012年共随机抽检了山东省不同地区的1678头样本。结果表明,牛结核与副结核病的阳性率从2010年的35.42%和29.34%下降至2012年的25%和14.93%。这说明,通过系统的监测及无害化处理阳性牛、隔离可疑牛等措施能够使牛群结核与副结核病逐步得到控制,进而实现净化。