家蚕GSK3α氨基酸序列分析及其mRNA转录水平研究

【目的】对家蚕(Bombyx mori)糖原合成酶激酶3α(GSK3α)蛋白的氨基酸序列进行分析,并检测家蚕不同发育时期及蜕皮激素、饥饿处理下,GSK3α基因mRNA转录水平的变化。【方法】以家蚕为供试材料,采用RTPCR和荧光定量PCR方法,研究家蚕GSK3α在不同发育期的表达和转录情况,及激素和饥饿处理对其转录的影响。【结果】家蚕GSK3α基因由2个外显子和1个内含子构成,其中内含子长度为1 411 bp,预测家蚕GSK3α蛋白质分子质量为33.78 ku,等电点为7.61。氨基酸系统进化树和序列多重联配分析结果表明,家蚕GSK3α与所选几种昆虫GSK3α的序列一致性较高(79%～91%)。家蚕GSK3α mRNA在幼虫取食期转录水平较高,在蜕皮期转录水平较低。在注射后6 h内,蜕皮激素对家蚕GSK3α基因mRNA的转录无诱导作用,但在注射12～24 h有较强的诱导作用,而且在注射12 h时诱导活性达到最高,之后逐渐降低。饥饿处理对家蚕GSK3α mRNA的转录水平影响较小。【结论】家蚕GSK3α在昆虫的进化过程中是比较保守的,其表达受到蜕皮激素的调控,饥饿处理对其转录水平影响较小。     

家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析

【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因，分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶（BmAK, Bombyx mori arginine kinase）基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。【结果】克隆了BmAK基因, cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸，具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列，酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸；该基因由2个外显子和1个内含子组成；5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ等多个潜在转录因子结合位点，但没有TATA盒启动子序列；该基因的表达在不同组织和不同发育时期存在明显差异。【结论】BmAK具有精氨酸激酶的典型特征，BmAK基因表达随发育时期不同而发生变化，基因的表达可能受蜕皮激素调控。     

扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及不同发育阶段的表达分析

【目的】扶桑绵粉蚧是我国重要的入侵生物,其繁殖能力强,能危害棉花、扶桑、向日葵、南瓜、番茄等多种我国重要的经济作物。克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因,可为揭示扶桑绵粉蚧GSTs的生理功能提供参考。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长,并采用生物信息学方法分析其结构特征,用实时荧光定量PCR的方法研究其各个虫态的表达谱。【结果】克隆了扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长序列,该基因的开放阅读框包含651 bp的片段,编码217个氨基酸。DNA编码区由4个内含子和5个外显子组成,内含子的长度分别为90,123,67和70 bp;分隔的5个外显子的长度分别为18,50,96,80和500 bp。功能域分析结果显示,该蛋白在N末端和C末端均有GST的类似结构位点。多序列比对及系统进化树构建结果表明,该蛋白属Zeta家族GSTs,将其命名为PsGSTzl。PsGSTzl mRNA在扶桑绵粉蚧的不同虫态中都有表达,在1龄幼虫中的表达量最高。【结论】成功克隆的PsGSTzl基因在不同虫态中差异表达,为进一步揭示该基因在虫体的代谢作用奠定了基础。     

家蚕Bmugt3基因cDNA序列的克隆、表达与序列分析

【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。     

华山松大小蠹β-肌动蛋白基因的克隆与组织表达

【目的】获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因序列,探讨其作为内参基因的可行性。【方法】通过比对其他昆虫β-肌动蛋白的氨基酸序列设计简并引物,用PCR的方法获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR的方法,研究β-肌动蛋白基因在华山松大小蠹不同发育阶段和成虫不同组织的表达情况。【结果】获得了1 461bp的华山松大小蠹β-肌动蛋白基因cDNA序列,与其他昆虫肌动蛋白基因核苷酸序列的相似性在86%以上,且该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹、成虫3个发育阶段以及成虫的头、胸、腹、足、翅等组织中表达稳定,且表达量无明显差异。【结论】成功获得了华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,且该基因片段可以作为基因表达差异性研究的内参基因。     

华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达

【目的】克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因的全长序列,并对其序列特征及不同发育时期的表达规律进行研究,以揭示谷胱甘肽S-转移酶在华山松大小蠹克服寄主抗性及物质转运过程中的分子调控机制。【方法】采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转酶基因全长cDNA序列,用实时荧光定量PCR检测该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹和雌雄成虫中的表达情况。【结果】获得cDNA全长为973bp的华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因,并命名为DaGSTe1(GenBank登录号:KJ637332),其编码一个由218个氨基酸组成的多肽,分子质量约为23.567ku,理论等电点为7.90。华山松大小蠹DaGSTe1与山松大小蠹DpGSTe1氨基酸序列的相似度最高,达94%。根据对系统发育树的分析推测,DaGSTe1属于Epsilon类谷胱甘肽S-转移酶。DaGSTe1蛋白三维结构包括一个N端结构域和一个C端结构域,其中N端结构域包括典型的4个β片层和3个α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3),C端结构域包括5个α螺旋(α4α5α6α7α8)。DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育期均有表达,其中在雄性成虫中的表达量最大,为幼虫和蛹的8倍,雌性成虫的4倍。【结论】克隆得到了华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶家族基因DaGSTe1,推测该基因具有降解寄主毒素的作用,而且参与华山松大小蠹雄性特异性激素的转运过程。     

家蚕细胞色素C基因的克隆及其蛋白在家蚕凋亡细胞中的释放

 【目的】细胞色素C是线粒体凋亡路径上的关键因子,通过家蚕细胞色素C基因的克隆和其蛋白在家蚕凋亡细胞中的释放研究,为家蚕细胞凋亡的研究奠定基础。【方法】利用生物信息学和分子生物学方法克隆家蚕细胞色素C基因,通过紫外线照射诱导家蚕细胞凋亡,应用流式细胞仪和Western-blotting检测家蚕凋亡细胞的线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放。【结果】在家蚕中克隆了一个含有细胞色素C保守结构域的同源基因,该基因cDNA长570 bp,有3个外显子,开放阅读框（open reading frame,ORF）长324 bp,编码108个氨基酸,存在参与细胞凋亡时与下游凋亡蛋白酶激活因子（Apaf－1）相互作用的保守关键位点;紫外线诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1凋亡后12 h,细胞线粒体跨膜电位明显下降,同时检测到了细胞色素C由线粒体向细胞质释放。【结论】在家蚕细胞凋亡中可能存在细胞色素C由线粒体释放的路径。     

家蚕感染质型多角体病毒相关基因Arylphorin的克隆与鉴定

【目的】克隆家蚕Arylphorin的cDNA全长序列,利用生物信息学对该序列进行分析,检测该基因在家蚕感染质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV）后的表达量变化模式,为进一步研究其生物学功能奠定基础。【方法】以家蚕中肠总RNA为模板反转录合成cDNA,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆家蚕Arylphorin的全长cDNA;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析其组织表达模式和在家蚕感染BmCPV后的表达差异。【结果】克隆得到了家蚕Arylphorin的全长cDNA（命名为BmAryl）,在GenBank登录号为JN581664。该基因的cDNA全长为2 260 bp,包含1个26 bp 5′非翻译区和1个143 bp的3′非翻译区,3′非翻译区包含有终止密码子、多聚腺嘌呤信号AATAAA和poly(A)尾。其最大开放阅读框（ORF）为2 091 bp,编码的蛋白由696个氨基酸组成,预测蛋白分子量为82.8 kD,等电点为6.07。多序列比对和系统进化分析发现,家蚕BmAryl蛋白与家蚕的性别专一贮藏蛋白2相似性最高,为66%。BmAryl主要在家蚕的脂肪体和血淋巴中表达,精巢和卵巢中的表达量无明显差别;而在家蚕感染BmCPV后该基因在中肠的表达量明显下调。【结论】成功克隆获得BmAryl的全长cDNA,其编码的蛋白质属于芳香蛋白家族, BmAryl主要在家蚕的脂肪体和血淋巴中表达,不存在性别专一性,且家蚕感染BmCPV后BmAryl在中肠的表达明显下调。     

不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。     

家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp,其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kD,等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析

[目的]克隆分析香蕉中14-3-3蛋白编码基因。[方法]采用PCR与RACE技术相结合的方法克隆香蕉14-3-3基因,并进行CDNA测序及同源性分析。[结果]所克隆cDNA全长866 bp,编码197个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的特征结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的序列相似性,将其命名为Ma-14-3-3d(Musa acuminate14-3-3gene)。[结论]Ma-14-3-3d蛋白与来源于单子叶植物的14-3-3蛋白位于同一进化枝上。     

野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建及丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆与序列分析

[目的]构建野桑蚕中肠组织cDNA文库并分离其丝氨酸蛋白酶基因。[方法]利用TaKaRa公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕中肠组织的cDNA文库,并采用测序法克隆分析丝氨酸蛋白酶基因cDNA。[结果]经鉴定,文库的滴度达6.2×105pfu/ml,文库插入片段的平均大小为1.2 kb左右。从文库的测序结果中获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶基因片段(登录号:EU672968),序列分析结果显示:该基因片段由854个核苷酸组成,编码284个氨基酸残基。通过对该基因片段编码的氨基酸和其他10种昆虫的丝氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸的同源性分析,发现该氨基酸序列与其他丝氨酸蛋白酶具有一定的同源性。[结论]该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对外来入侵物的抗性具有重要意义。     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究

[目的]研究家蚕抗菌肽attacin基因在不同诱导源诱导时的表达情况。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,半定量PCR检测attacin基因在诱导后的家蚕血液和脂肪体的表达情况,对诱导表达产物进行克隆测序及进一步的分析。[结果]attacin基因在所有诱导后的脂肪体中均出现1条800 bp左右的特异表达条带,克隆测序（GenBank登录号：FJ373020）后发现其产生由正常表达形式的2个内含子未被剪接引起,且原序列第1内含子5′端的1个TGA终止密码子使得加长的特异表达序列翻译氨基酸时在此处终止,最终导致了attacin C末端结构的缺失。[结论]attacin基因有2种剪接形式,该研究对探明atta-cin基因在家蚕免疫中的作用具有参考价值。     

甘蔗14-3-3基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗14-3-3基因并预测分析其编码蛋白的结构,为研究甘蔗基因功能和代谢调控机制提供参考.[方法]以水稻14-3-3基因为模板,BLAST甘蔗EST数据库,依据序列拼接结果及RT-PCR技术获得编码甘蔗14-3-3蛋白的全长基因,并用生物信息学方法对该蛋白的二级、高级结构和功能活性位点进行预测.[结果]克隆得到长784bp的甘蔗14-3-3基因,最大开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸;该蛋白的分子量与理论等电点分别为28.88 kDa和4.79.蛋白聚类分析结果表明,甘蔗14-3-3蛋白与水稻、高粱、玉米14-3-3蛋白的同源性均在90％以上.Cn3D V.4.1预测位于第3和第5两个二聚体上的Lys-50、Arg-57、Arg-131和Try-132组成一个凹穴,是结合靶蛋白的作用面;第60、65、188、218位的4个丝氨酸是磷酸化的活性位点.实时定量PCR检测结果表明,14-3-3基因在甘蔗不同组织中均有表达,在茎和分生组织中14-3-3基因高丰度表达,可能与糖代谢和细胞分裂的调控相关;而在根中可能参与矿物元素的吸收和代谢.[结论]甘蔗14-3-3基因可作为信号转导调控蛋白的候选基因之一.     

新疆野生盘羊TLR9基因的克隆·序列分析及其编码氨基酸结构预测

[目的]克隆鉴定新疆天山亚种野生盘羊Toll样受体9（TLR9）基因,预测其结构与功能,并对序列进行分析。[方法]以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法分3段克隆了新疆野生盘羊TLR9基因,PCR产物经凝胶回收纯化后测序,并运用分子生物学软件将测序结果进行分析及结构预测。[结果]克隆得到的新疆野生盘羊TLR9基因大小是3 192 bp,含1个完整的开放阅读框（ORF）,共编码1 064个氨基酸,其氨基酸组成中亮氨酸的含量高达18.51%,含有30个氨基酸的信号肽序列;在野生盘羊TLR9蛋白455～4757、40～760和780～800位氨基酸有3个跨膜区;新疆野生盘羊TLR9蛋白的3D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列（LRR）和胞内段TIL（Toll/IL IR）结构域构成的。[结论]上述结构特征为TLR9发挥生物学功能奠定了基础,同时也为进一步研究新疆野生盘羊TLR9基因提供了理论依据。     

玉米ZmCIPK42原核表达载体构建及蛋白纯化

[目的]分析玉米ZmCIPK42序列,诱导蛋白表达,并获得纯化的蛋白.[方法]利用蛋白分析软件分析ZmCIPK42性质及磷酸化作用位点,构建ZmCIPK2-pET30a原核表达载体,用IPTG诱导蛋白表达,用NiNTA树脂纯化蛋白.[结果]ZmCIPK42具有典型的CIPK家族基因的N端激酶结构域和C端NAF调控域,激酶结构域内有较多磷酸化位点,原核表达的ZmCIPK42主要以包涵体形式存在,用Ni-NTA树脂可以纯化获得有活性的ZmCIPK42蛋白.[结论]28℃诱导后ZmCIPK42可以有活性的蛋白.用His作为标签纯化ZmCIPK42蛋白,可高效获得大量纯化蛋白.     

蓖麻RcAKT1基因的克隆与序列分析

[目的]对蓖麻Rc AKT1基因进行克隆和序列分析。[方法]提取盐胁迫处理的蓖麻新鲜叶片总RNA,采取RACE法克隆蓖麻Rc AKT1基因的3'末端和5'末端,利用生物信息学软件DNAman对两端序列进行拼接,最后设计一对特异性引物,从而获得蓖麻Rc AKT1基因的ORF全长序列,并对该序列进行生物信息学分析。[结果]该基因的开放阅读框序列长度为2 253 bp,推测可不间断编码751个氨基酸。选取其他植物的AKT1序列与蓖麻Rc AKT1序列进行比对,结果显示同源性很高,其一致性在84%~97%。[结论]经过生物信息学分析,发现蓖麻Rc AKT1属于ANK超级家族,是亲水性蛋白质。     

黄金鲈鱼的一种ZP基因的电子克隆与鉴定分析

[目的]克隆分析黄金鲈鱼的一种邪基因。[方法]利用生物信息学手段克隆了黄金鲈鱼的一种ZP基因的全长CDNA序列,并对其序列进行了分析。[结果]该cDNA序列包含1653bp的开放阅读框,编码550个氨基酸。氨基酸序列同源性分析和进化分析表明,黄金鲈鱼的ZP蛋白与丰滑舌鳎ZP3b和青鳝ZPC5具有较高的同源性。[结论]所获得的黄金鲈鱼的ZP基因属于ZP3类型。     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

油桐种子FADX基因的克隆和序列分析

[目的]克隆油桐种子FADX基因全长cDNA。对该基因作生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能提供参考。[方法]以未成熟的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物;采用RTPCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,应用Antheprot软件和InterProScan对该基因进行了生物信息学分析。[结果]该序列5'端和3'端非编码区序列长度分别为13、47 bp,含有1个开放阅读框(14～1 174 bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域;相对分子量是44 343.0,理论等电点为8.33。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋含量占29%,β折叠占32%,转角占6%。[结论]该蛋白属于脂肪酸脱氢酶。