用高通量测序技术研究松辽黑猪与长白猪背最长肌mRNA和lncRNA的差异表达

【背景】肌肉生长和脂肪沉积是猪生产中非常重要的经济性状,同时也是复杂的数量性状,受到众多因素的影响。长白猪原产于丹麦,是目前世界上使用最为广泛的瘦肉型猪种之一,具有生长速度快,瘦肉率高等特点,但肉质欠佳。松辽黑猪是以民猪、长白猪和杜洛克猪为素材经过三元杂交育成的黑色母系地方培育品种,具有繁殖率高、肉质优良、适应性强、耐粗饲等特性。二者在肉质方面存在较大差异。【目的】采用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪的背最长肌转录组进行分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA),为猪肉品质研究提供新的参考信息。【方法】采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌作为样本,提取其RNA,将每个品种内的个体取等量RNA混池,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对混池后的样本RNA进行测序,然后对所获得的Reads进行比对、注释和差异表达等分析,筛选出差异表达mRNA和lncRNA并进行相关生物学功能富集分析。而后在筛选出的差异表达mRNA和lncRNA中各挑选10个基因,包括5个上调基因和5个下调基因,采...     

松辽黑猪肌内脂肪沉积相关基因的筛选

为了了解松辽黑猪肌内脂肪沉积的分子遗传学机理,利用基因芯片技术对松辽黑猪群体内背最长肌肌内脂肪含量高和低的个体进行了转录分析,利用实时定量PCR对部分转录差异基因进行了检测。差异表达分析显示,共有153个基因显著变化;差异基因经GO分类显示,主要参与细胞生长与死亡、信号分子及互作、信号传导、氨基酸代谢、脂类代谢等生物学过程;所验证的IGF2、PRKAG3、UCP3基因与芯片结果基本一致。本研究为深入了解松辽黑猪肌内脂肪沉积的机理奠定了基础。     

基于全基因组重测序筛选南阳黑猪脂肪沉积相关候选基因

为解析南阳黑猪种群中脂肪表型极端差异个体之间的遗传变异基础,本研究以南阳黑猪种群中体重相近但脂肪表型差异明显的6月龄全同胞或半同胞个体为研究对象,分别对其进行胴体性状和肉质性状统计分析,采用高通量测序技术对高脂肪组和低脂肪组的样品进行全基因组重测序,整合课题组前期转录组数据分析南阳黑猪脂肪沉积相关的遗传位点和功能基因。结果表明:1)高脂肪组肌内脂肪含量((4.96±0.62)%)显著高于低脂肪组((3.61±0.11)%)(P<0.05),高脂肪组平均背膘厚((43.74±2.33)mm)极显著高于低脂肪组((28.36±4.17)mm)(P<0.01),与肌内脂肪含量相关的性状(剪切力、pH_{45 min}、蒸煮损失和48 h滴水损失)在两组之间均存在显著差异,其余各项性状指标在两组之间无显著差异;2)本次测序共得到208.00 Gb有效序列数据,测序覆盖度达98.68%以上。在高-低脂肪组共检测到25 827 091个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)、5 802 822个小片段插入和缺失(Insertion-deletion,InDel)、56 358个染色体结构变异(Structural variation,SV)及1 898个拷贝数变异(Copy number variation,CNV)。通过对SNP非同义突变和InDel移码突变进行功能注释,发现所鉴定到的209个组间差异基因主要参与到mTOR信号通路、甲状腺信号通路以及ABC 转运蛋白信号通路等与脂肪沉积相关的通路中;3)与课题组前期转录组数据联合分析后筛选到2个与脂肪分化相关的关键基因(PLP1和ITGA6),这些基因的多态性变化可能是影响南阳黑猪肌内脂肪沉积出现差异的关键。综上,本研究从全基因组水平上筛选到了南阳黑猪群体内影响脂肪沉积相关的基因和位点,为进一步研究猪脂肪沉积调控机制及品种选育奠定基础。     

基于UPLC-MS/MS对犏牛肌肉脂质组的定量分析

为全面了解犏牛肉的营养价值,采用UPLC-MS/MS脂质组学技术对犏牛背最长肌的脂质组进行定性、定量分析.结果显示,从8个犏牛背最长肌样品中共检测到296种脂质分子类型,其中甘油三酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的种类及相对含量占比较高,分别为97种(44.91％)、52种(44.40％)、42种(44.91％)、...     

安格斯牛和南阳牛肌内脂肪组织中差异表达circRNAs分析

【目的】筛选牛肌肉脂肪组织中差异表达的circRNAs,为进一步探索circRNAs在牛肌内脂肪沉积和代谢过程中的潜在作用及肉牛改良提供理论基础。【方法】采集安格斯牛和南阳牛右侧背部最长肌第12/13肋骨间肌肉,分离其脂肪组织并提取RNA,采用RNA-seq和生物信息学方法分析2种牛肌内脂肪组织中circRNAs的表达情况,筛选差异表达的circRNAs,并对其进行GO和KEGG富集分析。选取4个差异表达的circRNA(circRNA.9560、circRNA.7431、circRNA.2083、circRNA.6528),对其表达水平进行qRT-PCR验证。【结果】在所有牛样本肌内脂肪组织中共检测到14 649个circRNAs,从中筛选并初步鉴定出111个安格斯牛与南阳牛差异表达的circRNAs,其中有75个在安格斯牛肌内脂肪组织中表达上调,36个表达下调。差异表达的circRNAs主要富集于细胞进程、单有机体进程、代谢过程、细胞、细胞部分、细胞器、分子结合、催化活性、核酸结合转录因子活性的GO条目中。KEGG富集分析结果发现,差异表达的circRNAs共富集到66条信号通路中,其中具有显著差异(P0.05)的信号通路有10个。qRT-PCR验证结果显示,circRNA.9560和circRNA.7431表达量显著下调,circRNA.2083和circRNA.6528表达量显著上调,与测序结果一致。【结论】筛选出111个安格斯牛与南阳牛差异表达的circRNAs,这些circRNAs可能在牛脂肪沉积和脂质代谢过程中发挥着一定的调控作用。     

重度冷应激下民猪背最长肌应答分子调控网络分析

为解析家猪在重度冷应激下骨骼肌应答反应的分子机制,本研究利用民猪的重度冷应激模型结合RNA-seq测序技术,对遭受重度冷应激后民猪背最长肌的基因和lncRNA的表达变化、功能注释以及两者间的调控关系进行了分析。结果表明：1）民猪在遭受3d的重度冷应激（-17℃～-26℃）后,背最长肌的53个基因发生了显著上调表达,35个基因发生了显著下调表达;53个lncRNA发生了显著上调,38个lncRNA发生了显著下调。差异表达基因中有多个与炎症反应相关的基因,如AREG、HAS1、MMP25和SLC11A1等基因发生了显著上调表达;与低温胁迫相关的TREH和与应激反应相关的TRIB3、与碳水化合物、葡萄糖和脂质代谢相关的HGFAC等基因也发生了显著上调表达。2）差异表达基因所参与的生物过程主要集中在胶原代谢、伤口愈合表皮细胞扩散和肌肉肥大调节过程等,且多位于细胞外区间;差异表达基因显著富集的生物学通路仅1个MAPK通路。3）存在显著表达差异的91个lncRNA顺式调控129个基因,反式调控750个基因,lncRNA与靶基因间的互作关系复杂。预测到的靶基因显著富集到MAPK和TNF 2个生物学通...     

高低肌内脂肪猪背最长肌关键基因表达差异分析

【目的】筛选出高肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积的关键基因并进行表达验证,为揭示猪肌内脂肪沉积的分子调控机制提供理论依据。【方法】根据NCBI-GEO数据库中高、低肌内脂肪巴克夏群体的转录组数据,利用DESeq2进行差异表达基因筛选(|log₂Fold Change|≥1,FDR<0.05),采用Metascape对差异表达基因进行功能富集分析,通过MCODE筛选及鉴定出高肌内脂沉积的关键基因,并采用实时荧光定量PCR在地方猪(柯乐猪)和外种猪(杜长大猪)上进行关键基因表达量验证。【结果】从高、低肌内脂肪巴克夏群体6个文库中共鉴定出7661个基因,高肌内脂肪群体样本的脂质代谢相关基因总表达量显著高于低肌内脂肪群体样本(P<0.05,下同),其中差异表达基因有133个[110个上调(在高肌内脂肪群体高表达),23个下调(在低肌内脂肪群体高表达)]。上调差异表达基因主要富集于胶原蛋白绑定、细胞外基质组装、脂肪酰辅酶A生物合成过程、固醇代谢过程和脂质代谢调控过程等GO功能条目,以及脂肪乙酰辅酶A生物合成、ChREBP激活代谢基因、脂肪酸代谢等信号通路上;下调基因主要富集于线粒体组装、多细胞生物学过程、辅酶绑定和缺氧反应等GO功能条目,以及基于NFKB的TNFA信号、白细胞介素4和白细胞介素13信号和干扰素信号等信号通路上。通过MCODE分析共筛选获得5个关键基因,分别是SLC25A5、FN1、FASN、ACACA和PRKDC基因;挑选SCD、FASN和ACACA基因进行表达量验证,结果发现这3个基因的相对表达量均表现为柯乐猪高于杜长大猪,其差异达显著或极显著(P<0.01)水平,进一步佐证SCD、FASN和ACACA基因在高肌内脂肪猪群体中高表达。【结论】在巴克夏猪高肌内脂肪群体中高表达的SCD、FASN和ACACA基因,在高肌内脂肪的柯乐猪中也呈显著或极显著高表达,因此这3个关键基因有望作为筛选和培育高肌内脂肪猪品种的分子标记,同时为研究肌内脂肪沉积的分子调控机制提供技术支撑。     

姜曲海猪瘦肉型品系(零世代)仔猪背最长肌肌内脂肪酸组成及含量的研究

选取姜曲海猪瘦肉型品系(零世代)仔猪24头,按初生及15、30、45、60、75日龄分成6个阶段,每日龄段4头,分别屠宰后取3～5 g背最长肌,经甲酯化后用气相色谱法测定各日龄段的肌内脂肪酸含量。结果表明:饱和脂肪酸含量随着日龄的增长(初生～60日龄)而逐渐减少,60～75日龄又有所升高。不饱和脂肪酸含量在断奶前较稳定(600 mg·g-1左右),断奶～60日龄降至505.1 mg·g-1,此后又升高至75日龄的620.0 mg·g-1;不饱和脂肪酸(主要为单不饱和脂肪酸)含量较高,这是该品系猪肉质优良的种质特性指标之一。     

松辽黑猪×野猪杂交猪H-FABP mRNA基因的组织分布研究

1材料与方法 1．1材料松辽黑猪X野猪杂交猪（含野猪血缘50％）组织样品采自吉林省农业科学院畜牧分院,采集的皮下脂肪、腹脂、乳腺、背最长肌、臂三头肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、回肠、十二指肠共计12种组织样品迅速置于液氮中,实验室-80℃保存。     

利用肉色相关候选基因对肉色性状进行预测

1)选用肥育期苏太猪100头,屠宰后取背最长肌,采用相对定量RT-PCR法测定肉色候选基因肌红蛋白(MB)、肌细胞增强因子(MEF2)、钙调神经磷酸酶(Calcineurin)和活化T细胞核因子(NFATc1)mRNA水平;分别测定MB浓度和肌肉表观色度参数,并对肉色进行评分,再分析上述参数间的相关性.结果显示:MB mRNA与肉色评分(r=0426**(**:P＜001))、a*值(r=0379**)、MB浓度(r=0364**)均呈正相关;NFATc1 mRNA与肉色评分(r=0407**)、a*值(r=0406**)、MB浓度(r=0345*(*:P＜005))、MB mRNA(r=0571**)也均存在正相关;且肉色候选基因表达之间均呈正相关.2)选用生长速度慢的肉脂兼用型二花脸猪与生长速度快的瘦肉型大白猪,分别于3、20、45、90、120和180日龄采集背最长肌样品,用相对定量RT-PCR法分析背最长肌中肉色相关候选基因表达的发育性变化,并进行品种和性别间比较.结果显示:MB、MEF2、Calcineurin mRNA发育性变化在品种间二花脸猪高于大白猪;NFATc1 mRNA则相反,大白猪高于二花脸猪.两品种MB、NFATc1、Calcineurin mRNA均在20日龄急剧升高,MEF2在两品种间差异最大,除3日龄外,二花脸公猪均显著高于大白公猪.性别间二花脸公、母猪MB mRNA和MEF2 mRNA仅在发育后期180日龄有显著差异,Calcineurin mRNA和NFATc1 mRNA在整个发育阶段均无显著差异.结论:推定最佳早期选育时间点为20日龄.     

肌内脂质参与形成板鸭风味的模拟体系研究

初步研究了肌内脂质参与形成板鸭风味的模拟体系。通过模拟体系中肌内脂质的去除与否或是否添加磷脂酶,比较风干(依据板鸭加工的风干条件)后腊香味的产生的强弱。结果表明,肌内脂质特别是磷脂对板鸭腊香味产生的作用很大。     

简州大耳羊早期胎儿到新出生阶段背最长肌中可变剪接的鉴定与分析

可变剪接广泛存在于动植物的各个组织中,是形成动植物体内蛋白质多样性和复杂性的重要机制之一。以简州大耳羊为研究对象,采集母羊妊娠期第45天、60天、105天胎儿以及出生后第3天羔羊的背最长肌组织,进行转录组测序。测序数据经比对、组装后,共鉴定出来自于4 562个(16.77%)已注释基因的137 308个可变剪接事件。其中,所占比例最高的类型为外显子跳跃(30.64%),而3′端可变剪接位点、内含子保留、5′端可变剪接位点的比例分别为19.47%、18.07%和10.92%。对RBMs、HNRNPs和SRSFs 3类可变剪接调控因子中58个基因表达量分析表明,19个基因的表达量呈现显著差异(P0.05);其中15个基因在妊娠期第45天和第60天的表达量显著高于其他2个阶段。GO功能注释和富集分析结果表明,4个阶段均发生可变剪接的基因显著富集在细胞表达调控和物质合成等过程(P0.05)。值得注意的是,在妊娠期第60天,可变剪接事件、可变剪接基因的数量和可变剪接因子表达量均显著高于其他阶段,并且特异性基因显著富集在有丝分裂和大分子合成相关过程。上述结果表明,妊娠期第60天胎儿的成肌过程非常活跃,暗示可变剪接在山羊背最长肌发育过程中具有重要作用,为深入探索可变剪接在山羊肌肉发育中的作用提供理论依据。     

不同品种绵羊肌内脂肪沉积相关miRNA的筛选与功能预测

为明确不同品种绵羊(Ovis aries)肌肉组织miRNA的表达情况,筛选影响绵羊肌内脂肪沉积的关键miRNA,以滩羊、杜泊羊和小尾寒羊为研究对象,测定背最长肌肌内脂肪含量并对其进行转录组测序(RNA-Seq),筛选绵羊脂肪沉积相关的差异表达miRNA。结果表明,滩羊肌内脂肪含量显著高于杜泊羊,极显著高于小尾寒羊;杜泊羊肌内脂肪含量显著高于小尾寒羊。转录组测序质量良好。3个品种绵羊共鉴定到134个已知miRNA和153个预测miRNA,这些miRNA的长度主要介于21～23 nt,且首位碱基对U碱基具有明显偏好性。以P≤0.05和|log₂FC|>1(FC为差异倍数)为筛选条件,3个比较组共获得42个差异表达miRNA;杜泊羊与滩羊比较组中筛选出22个差异表达miRNA;小尾寒羊与杜泊羊比较组中筛选出21个差异表达miRNA;小尾寒羊与滩羊比较组中筛选出12个差异表达miRNA。筛选出的42个miRNA靶向到326个靶基因,显著富集到减数分裂I、肌肽-寡糖1,2-α-甘露糖苷酶活性和甘露寡糖甘露糖苷酶活性等303个基因本体(GO)条目,以及富集到α-亚麻酸...     

肥育猪背最长肌中CaN、NFAT和CaM蛋白表达量与剪切力的相关性研究

为了研究饲粮蛋白水平对猪骨骼肌中CaN,NFAT和CaM蛋白表达量及肌肉剪切力的影响,探讨各个蛋白表达与剪切力之间的关系.试验选用90头约50kg的杜洛克×长白×大白三元杂交猪(公母各半,公猪去势),随机分为3个处理组,每个处理组3个重复,每个重复10头,分别饲喂蛋白质水平为12％、16％和20％的饲粮,各饲粮能量及氨基酸模式保持一致,饲养58d后屠宰取样,用蛋白质免疫印迹法测定猪背最长肌中CaN、NFAT和CaM的蛋白相对表达量.结果表明:饲粮中不同蛋白质水平对猪骨骼肌中CaN蛋白相对表达量影响极显著(p＜0.01),对NFAT和CaM蛋白相对表达量无显著影响(p＞0.05),但随着饲粮中蛋白水平升高而升高;CaN、NFAT和CaM在骨骼肌中蛋白相对表达量的变化呈正相关,且相关性非常明显(p＜0.01);CaN、NFAT和CaM的蛋白相对表达量越高,骨骼肌剪切力值越高,但相关性不明显(p＞0.05).提高饲粮中的蛋白质水平将促进CaN、NFAT和CaM的表达,从而促进钙调磷酸酶-NFAT信号通路发挥作用,钙调磷酸酶-NFAT信号通路可能影响肌肉嫩度.     

槐猪和杜洛克猪背最长肌差异表达基因的筛选与注释

为了筛选槐猪和杜洛克猪背最长肌中的差异表达基因,对槐猪和杜洛克猪背最长肌进行转录组测序,并进行生物信息学分析.结果表明,槐猪和杜洛克猪分别获得36 177 844和34 496 450条可用读段,且与猪参考基因组的比对率分别为78.71%和80.09%.槐猪和杜洛克猪间共有953个差异表达基因,以杜洛克猪为对照组,槐猪与之相比,有589个上调基因和364个下调基因.槐猪和杜洛克猪的差异表达基因共分类到48个基因本体(GO)条目中,其中,细胞组分13个、分子功能12个和生物学过程23个.显著富集的KEGG通路共计6个,其中,PPAR信号通路是与调节脂类代谢显著相关的通路.     

猪肌内脂肪沉积相关功能基因的研究进展*

 肌内脂肪含量是影响猪肉品质的最重要因素之一,目前已鉴定多个与肌内脂肪沉积相关的功能基因,为通过提高肌内脂肪含量改善肉品质提供了分子基础。综述了近年来关于猪肌内脂肪沉积相关功能基因的最新研究成果,为深入开展这些功能基因的研究提供参考。     

LncFAM200B对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

【目的】拟通过腺病毒介导的超表达及siRNA干扰试验,分析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的影响,为解析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的调控机制奠定基础。【方法】采集牦牛背最长肌组织,采用酶消化法和差速贴壁法分离牦牛肌内前体脂肪细胞;构建包装lncFAM200B超表达腺病毒,设计合成其siRNA干扰序列;通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析lncFAM200B超表达与干扰后脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1、PTEN的表达水平;采用油红O染色、甘油三酯（TAG）测定、CCK-8检测等方法检测细胞内脂滴沉积情况、甘油三酯含量变化及细胞增殖情况。【结果】从牦牛背最长肌成功分离获得肌内前体脂肪细胞;lncFAM200B超表达后,脂肪分化标志基因C/EBPα、AP2表达量显著升高（P<0.05）,随着诱导分化时间的增加,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1表达量呈先降低后升高的趋势,PTEN表达量呈现先增高后降低趋势;细胞脂滴沉积显著增加（P<0.05）,且胞内形成较大脂滴;超表达4 d后,细胞内甘油三酯含量显著增加（P<0.05）。干扰lncFAM200B可显著降低脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2的表达水平（P<0.05）,降低细胞脂肪沉积,且诱导分化第6天细胞内甘油三酯含量显著降低（P<0.05）;干扰lncFAM200B后其潜在靶基因SIRT1呈现先升高后降低的表达趋势,PTEN则相反。CCK-8增殖实验表明,lncFAM200B超表达72 h后,细胞增殖效率显著降低（P<0.05）,而干扰lncFAM200B后72 h后细胞增殖效率显著增强（P<0.05）。【结论】lncFAM200B可能通过影响脂肪分化标志基因C/EBPα和AP2,脂肪合成相关基因SIRT1和PTEN的表达从而影响牦牛肌内脂肪沉积,但其具体机制还需要进一步研究。     

二花脸猪和大白猪背最长肌中肌肉生长抑制素和生肌调节因子基因的表达及其性别特点

用相对定量RT—PCR方法研究大白猪和二花脸猪背最长肌中肌肉生长抑制素（Myostatin）和生肌调节因子（Myo—genin）基因表达的发育性变化并进行品种及性别间比较。研究结果表明：大白猪公猪Myostatin mRNA表达水平在20日龄时达到高峰且显著高于相同日龄二花脸公猪（P〈0．05）,而二花脸公猪在45日龄时才显著升高,其他日龄品种间差异不显著。二花脸公猪和母猪出生后Myostatin mRNA表达水平均表现为上升,45日龄时达到高峰,120日龄时公母猪间差异显著（P〈0．05）。二花脸公猪与大白猪公猪Myogenin mRNA的表达发育模式基本相同,均在20日龄达到最高值,品种问差异不显著。90日龄二花脸母猪Myogenin mRNA表达水平较公猪显著下调（P〈0．05）。结果提示,猪背最长肌中Myostatin和Myogenin基因表达水平在猪出生后早期均较高,但没有出现随着日龄的增加而一直升高或降低的趋势;两种基因的表达在20日龄出现品种间差异;性成熟前后二花脸公母猪间表达有差异。     

日粮中添加共轭亚油酸对肉仔鸡胸肌和腿肌脂质过氧化状态的影响

【目的】研究日粮中添加共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）对肉仔鸡胸肌和腿肌脂质过氧化状态的影响及原因。【方法】将96只1日龄AA（Arbor Acre）雄性肉仔鸡用玉米豆粕日粮饲喂至3周龄,在3周龄末,将其随机分为对照组和CLA组,分别饲喂基础日粮和CLA日粮,每处理8个重复,每重复6只鸡。42日龄时屠宰,剥离胸肌和腿肌,检测其中的脂肪酸组成和脂质过氧化相关指标。【结果】日粮中添加CLA降低了肉仔鸡胸肌和腿肌的丙二醛（MDA）(P＜0.01)和活性氧含量(P＜0.05)。2组肉仔鸡腿肌和胸肌中各种抗氧化酶活性无显著差异 (P＞0.05)。与对照组相比,CLA组肉仔鸡胸肌和腿肌的谷胱甘肽含量分别提高了21.89％和21.56%(P＜0.01),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性分别提高了28.57％和25.80%(P＜0.01)。日粮中添加CLA提高了肉仔鸡胸肌和腿肌总CLA(P＜0.01)及饱和脂肪酸（SFA）含量(P＜0.05),极显著降低了单不饱和脂肪酸含量(P＜0.01)。【结论】日粮中添加CLA改变了肉仔鸡胸肌和腿肌脂肪酸的组成,提高了脂质稳定性,同时增加了GSH含量,淬灭了更多的自由基,从而降低了脂质过氧化水平。