辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

为揭示Ca CBF1A基因在辣椒抗逆机制中发挥的功能,对辣椒Ca CBF1A基因进行克隆与分析。以豫椒101为材料,根据参考基因组序列设计引物,通过PCR技术从辣椒基因组c DNA中获得CBF基因Ca CBF1A。经生物信息学分析,该基因具有一个完整的ORF(471 bp),编码156个氨基酸。Ca CBF1A编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析,预测其定位在叶绿体中,存在跨膜结构。荧光定量PCR检测结果表明,低温、高温和盐胁迫均可诱导Ca CBF1A基因的表达,其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明Ca CBF1A是一个逆境胁迫快速响应基因,推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。     

辣椒GMS育性相关候选基因的克隆及表达分析

【目的】对辣椒差减文库中挑选出的4个育性相关候选基因进行克隆与表达分析,探讨其与辣椒细胞核雄性不育的关系。【方法】通过半定量RT-PCR技术分析候选EST在辣椒可育株和不育株中的表达情况。利用RACE技术获得4个育性相关基因的cDNA 全长,结合生物信息学方法进行序列比对和蛋白理化性质分析。采用半定量RT-PCR检测基因在不同器官（花药、子房、花瓣、萼片和叶片）和花药小孢子不同发育时期（四分体时期、单核早中期、单核靠边期和双核期）的表达量。【结果】根据比对注释结果,将4个基因分别命名为CaSEP1、CaPROF、CaOle e 6和CaPCP。CaSEP1全长1 108 bp,编码221个氨基酸,含有一个MADS结构域和一个K结构域;CaPROF全长767 bp,编码131个氨基酸,含有一个PROF结构域;CaOle e 6全长523 bp,编码85个氨基酸,含有一个Ole e 6结构域;CaPCP全长563 bp,编码66个氨基酸。氨基酸序列比对及系统发育树分析表明,CaSEP1与番茄SEP1的氨基酸序列相似性最高,并且亲缘关系最近;CaPROF与茄科作物烟草和番茄的前纤维蛋白相似性较高,且与番茄的前纤维蛋白亲缘关系最近;CaOle e 6与番茄中的对应蛋白存在一定的相似性,亲缘关系也最近;CaPCP则与茶树中的对应蛋白相似性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,CaSEP1在可育株花药、子房、花瓣等花器官中表达量一致,且高于萼片和叶片;CaPROF在可育株花药中的表达明显高于叶片,在其他器官中不表达;CaOle e 6在可育株花药中的表达明显高于其他器官;CaPCP只在可育株的花药中表达。CaSEP1在可育株小孢子不同发育时期表现为先逐渐升高,至单核靠边期达到最高,而后在双核期表达量明显下降,在不育株中则表现为伴随着小孢子发育表达量逐渐升高;该基因在四分体时期两材料的表达量相当,在单核早中期和单核靠边期可育株中的表达量明显高于不育株,而双核期可育株中的表达量比不育株低;CaPROF、CaOle e 6和CaPCP均在可育株小孢子发育后期（主要为单核靠边期和双核期）表达,在不育株花药发育的各个时期均不表达。【结论】4个候选基因的序列比对和表达分析结果表明它们与辣椒雄蕊育性关系密切,为揭示雄性不育机理和调控辣椒育性提供了重要信息。     

马铃薯PGA1基因的克隆及序列分析

糖苷生物碱是马铃薯块茎中普遍存在的一种有苦味的毒性甾类生物碱,其毒性可使人、动物变畸形或死亡,PGA1基因是催化糖苷生物碱合成的关键酶基因。通过同源克隆的方法,采用RT-PCR技术对马铃薯大西洋品种的PGA1基因进行克隆,获得了PGA1基因的c DNA序列;并对马铃薯PGA1基因进行生物信息学分析。结果表明,PGA1基因的CDS全长为1 497 bp,编码498个氨基酸,所编码蛋白的分子质量为57.087 ku,理论等电点为9.29,为不稳定蛋白;该蛋白的二级结构包括α螺旋(52.41%)、β转角(6.02%)、延伸链(12.85%)和无规则卷曲(28.71%),其中,α螺旋和无规则卷曲为主要元件,与预测的蛋白质三级结构一致。研究结果可为进一步深入了解PGA1基因的功能和调控机制,利用基因工程技术调控马铃薯中糖苷生物碱含量提供理论依据。     

文冠果LEC1基因的克隆及表达分析

目的文冠果隶属无患子科, 是我国北方重要的油料树种, 种子含油量高, 是制备食用油、生物柴油等的优质原料。本研究旨在克隆文冠果Leafy Cotyledon 1(XsLEC1)基因, 进行序列及表达模式的分析。方法以文冠果种胚为试材, 利用RT-PCR和RACE技术克隆文冠果LEC1基因。采用Protparam及TMHMM2.0软件预测XsLEC1蛋白的理化性质和跨膜结构域, ProtComp9.0及Motif Scan软件预测XsLEC1蛋白的亚细胞定位及蛋白功能, BioEdit及MEGA7软件分析XsLEC1蛋白的多重序列比对和进化关系。运用RT-PCR和实时荧光定量PCR分析XsLEC1基因的表达模式。结果XsLEC1 cDNA全长1 035 bp, 包含一个长度为690 bp的开放阅读框(GenBank号为MF616360), 可编码229个氨基酸。推导的氨基酸序列包含一个HAP3亚基的保守功能域B。该保守功能域内含有组蛋白折叠中的3个α螺旋(α1、α2、α3)和两个短环结构(L1、L2)。在线预测该蛋白为稳定的, 亲水性蛋白, 无信号肽和跨膜区域, 定位于细胞核, 存在多个磷酸化位点。二级结构主要由α螺旋和无规则卷组成。进化分析表明, 该蛋白序列与同科龙眼亲缘关系最近, 其次为麻风树和毛果杨。RT-PCR实验得出, XsLEC1基因在文冠果的根、茎、叶及花中均无表达, 在种子中出现较高表达。实时荧光定量PCR结果进一步显示, XsLEC1基因在种胚中有明显的时序表达特性, 在种胚发育的前期(花后33、40、47 d)表达较高, 在种胚发育的后期(花后54、61、68 d)表达较低, 至花后75 d时仅有微量表达, 而在完全成熟的种胚(花后81 d)中未检测到XsLEC1的表达。结论文冠果LEC1基因的克隆及表达分析, 为以后深入研究XsLEC1的功能奠定了分子基础, 同时对生产实践中文冠果油脂品质的改良有一定的实践意义。      

辣椒LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】克隆和分析抗、感疫病辣椒材料的抗病基因同源序列,为辣椒抗疫病相关基因的克隆奠定基础。【方法】根据番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9 C端的LRR类保守结构域设计简并引物,对6个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA进行抗病基因同源序列的PCR扩增。【结果】得到27个抗病基因同源序列(RGAs),其在GenBank中的登录号为EF064260~EF064286。其中,21个RGAs与番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9有较高的相似性。感病材料的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs。【结论】上述21个RGAs可能与辣椒抗疫病作用有关,可为辣椒抗疫病相关基因的克隆提供依据。     

辣椒质膜水通道蛋白CaPIP1基因全长cDNA的分离及序列分析

通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选分离获得了一个与烟草水通道蛋白NtAQP1高度同源的aquaporin基因全长cDNA,命名为CaPIP1。序列分析结果表明该cDNA包含有858 bp的完整开放阅读框,编码286个氨基酸,具有6个跨膜区,2个NPA模序以及植物质膜水通道蛋白高度保守的序列。氨基酸同源性及进化分析同样表明CaPIP1为辣椒水通道蛋白家族新成员。     

小豆抗病相关基因VaAC1的克隆与表达分析

利用简并引物从小豆中扩增出1条与植物几丁质酶基因高度同源的片段,命名为VaAC1,通过RACE技术延伸VaAC1基因的3’端和5’端,VaAC1基因完整ORF长度为885 bp,编码294个氨基酸,拥有几丁质酶蛋白家族典型保守结构域GH18_chitinase-like。RT-PCR分析表明,VaAC1基因在小豆根、茎和叶中均有表达,且在叶中的表达相对较高;大豆花叶病毒处理后,VaAC1基因在叶中的表达量显著增强,显示小豆VaAC1基因与病毒病密切相关。     

罗氏沼虾Dmc1基因的克隆及表达分析

DNA减数分裂重组酶1基因(disrupted meiotic cDNA 1,Dmc1)是在减数分裂过程中特异表达的基因。为了研究罗氏沼虾卵巢发育的分子机制,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得罗氏沼虾Dmc1基因的全长cDNA序列(MrDmc1),并对MrDmc1基因编码的蛋白进行理化性质、亲疏水性、亚细胞定位以及蛋白质结构等生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术检测Dmc1基因在卵巢、肌肉等组织中的表达量。结果显示,MrDmc1基因的ORF全长1 026 bp,共编码341个氨基酸;MrDMC1蛋白分子量为37.4 ku,该蛋白没有跨膜区域和信号肽切割位点,含有1个N-糖基化位点和25个磷酸化位点,是亲水性蛋白,主要存在于细胞质中。系统进化树发现,罗氏沼虾MrDmc1基因与克氏原螯虾、凡纳滨对虾等甲壳类动物进化关系较近。荧光定量PCR结果显示,MrDmc1基因在7种组织中均有表达,在心脏中表达量最高,在眼中表达量最低;MrDmc1基因的表达量在卵巢发育过程中呈先升高后降低的趋势,在卵巢发育Ⅱ期的表达量最高。研究表明,MrDmc1基因参与了罗氏沼虾卵巢发育的调控,推测...     

青稞“昆仑12号”HVA1基因的克隆与蛋白质结构预测

抗旱性是青稞重要的耐逆性状.根据已报道的大麦抗旱相关基因HVA1的DNA序列,设计引物,以青稞品种昆仑12号经干旱处理8h处理后的幼苗为材料,进行PCR扩增,得到约700 bp的HVA1基因编码框的全序列,将其克隆到pMD20 -T上,重组子和酶切鉴定正确后,进行序列测定和分析.结果表明,与西藏强旱性青稞中HVA1基因...     

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病菌（FMDV）（L1-L5）的RNA，用1对通用引物经RT-PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段，克隆后通过测序获得其核苷酸序列，分析表明，除L2株外，其余4株（L1，L3，L4和L5）VP1基因的核苷酸序列同源性在96.7%-99.8%。氨基酸序列同源性在99.5%-100%；而L2株与L1，L3，L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82.0%-83.4%，氨基酸序列同源性在89.7%-90.1%,L1,L3,L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86，HKN/1/99，HKN/16/96的同源性较高，核苷酸序列同源性在85.0%-99.8%，属于同一基因型；而与L2，F29/CHINA及国外大多数毒株相比，属于不同的基因型，其核苷酸序列同源性仅为41.0%-82.6%，5株毒株中的L1，L3，L4和L5的主要中和抗原位点140-160，200-213位氨基酸序列完全相同，推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性。     

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。     

辣椒小G蛋白CaRab11基因全长cDNA的分离及序列分析

通过分析克隆获得的辣椒Rab11全长cDNA及其编码的氨基酸序列结构特征,为进一步研究辣椒Rab11功能奠定基础.通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选分离获得了一个与葡萄Rab11小G蛋白VvRabAlf高度同源的全长cDNA,命名为CaRab11.序列分析结果表明:该cDNA包含有1164 bp的完整开放阅读框,编码217个氨基酸.该蛋白含有Rab GTP酶超家族保守的RabSF模体;Rab亚家族蛋白所特有的五个氨基酸序列RabF模体(RabF1-RabF5);参与GTP/Mg++结合及GTP水解的G结构域(G1-G5:GDSGVGKS,T,DTAGQE,GNKADL及ETSAL);两个构象变构域(Switch Ⅰ和SwitchⅡ)及与异戊二烯化相关的CCX序列.氨基酸同源性及进化分析同样表明CaRab11为辣椒小G蛋白Rab11家族新成员.     

秀珍菇原基形成相关基因PpFBD1的克隆与表达研究

前期研究中通过对秀珍菇经低温诱导后不同发育阶段样本进行转录组测序及差异表达基因分析发现,ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为PpFBD1)在原基形成前期的样本中高表达。为进一步了解分析其表达特性及功能,根据转录组测序结果设计特异性引物,利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆获得了该基因的cDNA全长。该基因由342个核苷酸组成,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白,蛋白相对分子质量约11 ku。进化树分析显示,PpFBD1编码蛋白与糙皮侧耳hydrophobin1编码的疏水蛋白亲缘关系最近。Gene Ontology功能分析表明,PpFBD1主要参与真菌类细胞壁的合成。荧光定量RT-PCR检测显示,该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温阶段(原基形成前期)表达量最高,这表明其可能参与调控秀珍菇原基形成过程。本研究结果为阐明秀珍菇原基形成机制提供参考。     

辣椒水通道蛋白基因CaAQP的克隆与序列分析

 【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE 技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并以4℃低温胁迫处理不同时间的抗寒品种P70为材料,利用Real time-PCR分析所克隆基因在辣椒低温胁迫前后的表达模式,以25℃处理为对照。【结果】在4℃低温胁迫处理后的耐寒辣椒品种P70叶片中分离到与水通道蛋白基因相关的差异表达片段,并利用RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为CaAQP,登录号为GU116569。序列分析表明,该基因大小为1 032 bp,含5′非编码区为69 bp,3′非编码区为210 bp,CDS长753 bp,编码250个氨基酸, 蛋白分子量为25.7 kD。应用生物信息学软件对CaAQP分析表明,CaAQP含有6个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其它物种TIP类液泡膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。聚类分析表明,CaAQP与番茄液泡膜水通道蛋白遗传距离最近,与禾本科的玉米和大麦遗传距离相对较远。Real time-PCR分析结果证实,该基因在低温胁迫下呈现下调表达的趋势。【结论】利用cDNA-AFLP并结合RACE技术首次在耐寒辣椒品种中克隆了水通道蛋白基因CaAQP,该基因属于MIP蛋白家族的一员,具有其典型的功能域,表达模式分析表明,该基因在低温胁迫过程中具有重要的调控作用,该研究结果为进一步探讨辣椒逆境胁迫过程中基因表达调控机制提供了重要信息。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析‘

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒基因组ＲＮＡ,采用ＰＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＥＧＭ＾Ｒ－Ｔ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆,并进行了序列测定。序列分析表明：扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５５３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－ＲＱ－Ｋ－Ｒ－     

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

 【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列（resistance gene analogs,RGAs）,聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2 基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。     

枸杞LbMYB1基因的克隆与表达分析

在前期的枸杞花药蛋白质组学研究鉴定差异表达蛋白的基础上,采用RT-PCR技术,从宁夏枸杞"宁杞1号"花药中克隆了一个花药发育差异表达MYB类蛋白基因。生物信息学分析表明,该基因编码R2R3类MYB转录因子的典型结构域,与其他物种MYB蛋白的氨基酸的相似性达72%以上,属于R2R3类MYB蛋白基因家族。将该基因命名为Lb MYB1,Lb MYB1包含一个975 bp的开放阅读框,编码324个氨基酸残基,分子量79.2 kv,等电点为4.95。实时定量RT-PCR检测表明,Lb MYB1基因在花药四分体形成时期高丰度表达,在花中的表达量也较高,果实中表达量较低,在根、茎及叶中未检测到表达,推测Lb MYB1基因可能与花药发育中有关。本研究为后继进一步探讨Lb MYB1蛋白在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能及其分子机理提供参考。     

关中奶山羊Prm1基因的克隆及真核表达

【目的】研究雄性奶山羊Prm1基因的表达规律并克隆该基因,为奶山羊精子发生过程的研究提供分子基础。【方法】利用PCR技术从关中奶山羊睾丸组织中扩增出Prm1基因的全CDS序列,对其进行同源性比较和进化比较。同时用PCR、western blotting及免疫组化技术检测Prm1在不同年龄雄性关中奶山羊睾丸中的表达。将克隆出的奶山羊Prm1基因与pIRES-GFP载体连接构建重组真核表达载体,转染GC1细胞和人的脐带基质细胞检测Prm1基因的超表达情况。【结果】Prm1基因在成年奶山羊睾丸组织中的表达量很高,且只定位于精子头部,在其它时期的睾丸组织中基本不表达。同时扩增得到了关中奶山羊Prm1 基因CDS序列,与其它物种比对,发现其与许多物种具有较高的同源性,与牛的同源性高达97.4%,最后在GC1细胞和人的脐带基质细胞中进行了超表达。【结论】得到了关中奶山羊Prm1基因的表达规律及完整的CDS序列。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。