一种改良的苏云金芽孢杆菌质粒DNA提取方法

以Sambrook的碱裂解法为基础,通过控制菌体培养时间,适当调整提取过程中3种溶液的比例及作用时间,摸索出一种适合于提取苏云金芽孢杆菌质粒DNA的方法.该法与常规碱裂解法相比具有重复性好、质粒DNA质量高等优点.     

苏云金芽孢杆菌质粒复制区的分离克隆

Bt-E.coli穿梭载体pHT315去除Bt复制区,构成了一个具有红霉素和氨苄抗性,同时具有多克隆位点的只能存E.coli中复制的载体,命名为pHT315-1。利用pHT315-1,通过部分酶切建库的方法,从近10 000个重组子中得到1个Bt复制区。序列测定结果表明,该复制区为5273bps,已在GentBank注册,Accession number为AY278324。GenBank核酸序列Blast表明,该复制区部分序列与Bt菌株HD263的复制区。ori43编码复制蛋白的宁列同源性为98％。30℃连续培养72h,复制区质粒在Bt无晶体突变株HD73cry-中稳定性达98％以上,30h生长曲线也表明,该复制区质粒对受体菌株无明显不良影响。     

苏云金芽孢杆菌原生质体的制备及大质粒转化

研究苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最佳条件,为进一步提高原生质体转化率打下基础。通过酶解法对苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种工业生产菌株(Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki)2671原生质体的制备及再生条件进行了研究,考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间等影响因素,采用PEG法对大质粒进行原生质转化。结果表明,对数生长前期的菌体(培养3 h),以SMML作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度7 mg/m L,40℃下酶解40 min,原生质体生成量可达5.7×107个/m L,再生率可达14.1%。在此条件下,采用PEG法可将大质粒p LTV1-ep成功转化宿主菌,转化率为0.3 CFU/μg。     

苏云金芽孢杆菌毒性研究

以菜青虫为试验材料,用苏云金芽孢杆菌浸泡过的小白菜饲喂菜青虫,提取菜青虫体内的伴孢晶体,通过生物测定法对苏云金芽孢杆菌的毒性进行研究,并对出发菌株进行紫外诱变筛选高毒性菌株。结果表明,苏云金芽孢杆菌毒性与伴孢晶体含量有关,伴孢晶体含量越多,毒力越高;紫外诱变16min时得到菌株B16,伴孢晶体含量比出发菌株提高8.2%,杀虫效率比出发菌株提高77%。该研究为苏云金芽孢杆菌生产高效率生物农药提供菌种。     

苏云金芽孢杆菌防治剂

世界卫生组织最近在西非利用苏云金芽孢杆菌杀虫剂,来防治盘尾丝虫病的传染媒介蚋。还在非洲利用苏云金芽孢杆菌杀虫剂防治丝虫病的传染媒介致卷库虫的幼虫。并已取得显著效果。     

电穿孔法用于大肠杆菌和苏云金杆菌的转化及质粒消除

利用电脉冲将质粒pHT3101和pHE－4D分别转入了大肠杆菌和苏云金杆菌,结果显示大肠杆菌DNA的转化率（转化子）为104～105·μg－1,苏云金杆菌的DNA的转化率（转化子）为102～103·μg－1．同时利用该法消除了Escherichiacoli菌株TG1和Bt菌株ISP78／11中的pHT3101质粒,消除率分别为88．6％和66．4％．比较了转化和质粒消除的条件并构建了一个工程菌．     

苏云金芽孢杆菌肠毒素的研究进展

苏云金杆菌含有多种毒素,与人畜条件病原菌—蜡质芽孢杆菌有紧密的联系。研究表明用PCR等方法可检测到很多苏云金杆菌含有与蜡质芽孢杆菌类似的多种肠毒素基因,而且,商用肠毒素试剂盒也能检测到有些苏云金杆菌肠毒素的产生,基因核苷酸序列分析表明苏云金杆菌肠毒素基因同蜡质芽孢杆菌肠毒素基因有较高的相似性。该文对苏云金杆菌毒素的基因检测、基因序列分析、活性检测及其安全性方面进行了综述。     

苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究

 建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。对探针长度、浓度、总DNA含量、标记方法以及灵敏度等条件进行了研究。结果表明,用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40～50mer、40μmol·L-1)杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因;不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P<0.01),而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3h;检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg;标记产物杂     

电穿孔法用于大肠杆菌和苏云金杆菌的转化及质粒消除

利用电脉冲交质粒ｐＨＴ３１０１和ｐＨＥ－４Ｄ分别转入大肠杆菌和苏云金杆菌,结果显示大肠杆菌ＤＮＡ的转化率为１０＾４－１０＾５．μｇ＾－１,苏云金杆菌的ＤＮＡ的转化率为１０＾２－１０＾３．μｇ＾－１,同时利用该法消除Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株ＴＧ１和Ｂｔ菌株ＩＳＰ７８／１１中的ｐＨＴ３１０１质粒,消除率分别为８８．６％和６６．４％。比较了转化和质粒消除的条件并构建了一个工程菌。     

苏云金芽胞杆菌不同分化发育时期总RNA的有效分离

将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）8010在LB液体培养基30℃、230r／min下振荡培养,通过生长曲线测定（OD600）和显微镜观察,分别在8、30、39、42h和46h取样得到营养生长期、孢子囊期和裂解期样品来提取总RNA。通过对试剂提取方法的改进,找到一种方法可以很有效的提取Bt3个不同分化发育时期（营养生长期、孢子囊期和裂解期）的总RNA。提取的总RNA质量很好,可以进行cDNA合成、RT-PCR和转录组学研究等下游实验。     

一种纯化苏云金杆菌Cry1Ac蛋白的方法

Cry蛋白的纯化技术在很大程度上制约了其结构与功能的研究.为此,提出了一种以等电点沉淀方法纯化苏云金杆菌Cry1Ac的原毒素,用分子筛层析纯化其活性毒素的方法.结果表明:Cry1Ac的原毒素在pH值5.05条件下沉淀纯化效果好;以纯化的原毒素激活进行分子筛层析,收集其最大峰便可获得较高浓度的活性毒素;该方法不仅纯化效果...     

Bt水稻“克螟稻”稻米毒理性评价研究初报

 经大鼠急性中毒试验确定 ,转Bt基因抗虫水稻稻米属无毒级。大鼠 90d喂养结果显示 ,各试验组大鼠体重、进食量和食物利用率与对照组均无显著差异。对大鼠肝、肾、胃、肠及睾丸进行组织切片检查 ,均未见病理性改变。大鼠脏体比、血象及血生化指标均在正常范围内 ,试验组与对照组无明显差异。     

新型高效价苏云金芽胞杆菌制剂的研制

通过对苏云金芽胞杆菌发酵后处理工艺的改进，运用超滤及喷雾干燥技术获得新型高效价粉剂．室内生物测定结果表明，该粉剂的杀虫效果为目前工厂常规产品的１０倍左右．同时，以ＣＳ－１９９１（Ｈ３ａｂ）作为标准品，３龄小菜蛾为供试虫，对其进行了毒力效价测定，测定的高效价粉剂死亡机率值与质量浓度对数值的回归方程为ｙ＝３．９３＋１．２６ｘ（ｒ＝０．９８），ＬＣ５０＝６．９８ｍｇＬ－１，效价为４７６１９．０８ＩＵｍｇ－１     

费氏中华根瘤菌内源质粒和大豆品种对菌株竞争结瘤能力及固氮效率的影响

 采用发光酶基因 (luxAB)标记技术 ,在无菌砂培条件下测定了费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii)内源质粒和大豆品种对供试菌株竞争结瘤和固氮效率的影响。结果表明 ,供试菌株的固氮效率主要由共生质粒所决定 ;而竞争结瘤能力主要取决于其染色体所携带的基因 ,内源质粒 (包括共生质粒和非共生质粒 )对供试菌株竞争结瘤能力没有明显的影响。菌株的竞争结瘤能力对供试的大豆品种依赖性较小 ,品种对不同组合中的菌株竞争结瘤能力影响效果不同     

陆地棉高强纤维品系和Bt基因抗虫棉的配合力与杂种优势研究

 采用NCⅡ设计 ,以 5个高强纤维品系为母本 ,12个Bt基因抗虫棉品系为父本配制杂交组合 ,分析了高强纤维品系与Bt基因抗虫棉品系杂交组合性状的配合力效应和杂种优势表现。结果表明 ,籽、皮棉产量、单株铃数和铃重具极显著的特殊配合力 (显性 )方差 ,衣分的一般配合力 (加性 )和特殊配合力方差均极显著 ,纤维品质2 .5 %跨长、比强度和麦克隆值具极显著的一般配合力方差。产量构成因素的优势单株铃数 >铃重 >衣分 ;纤维品质性状的群体平均优势 2 .5 %跨长 >麦克隆值 >比强度 ,竞争优势比强度 >2 .5 %跨长 >麦克隆值。利用高强纤维品系与Bt基因抗虫棉品系配制的杂交组合 ,F1代皮棉产量较现有推广品种增产 17.0 %以上 ,纤维比强度提高 ,长度增加 7.0 %以上 ,细度提高 4 .0 %以上。     

提高苏云金杆菌防治效果技术的研究

系统介绍了Bt的生理特征、杀虫机理以及在应用中存在的问题,提出了提高Bt防治效果的技术措施。     

苏云金芽孢杆菌发酵培养基的筛选

采用正交试验对BtWB7菌株发酵培养基进行筛选,结果表明,不同原料对发酵液菌数影响相差较大,其中酵母粉和鱼粉影响最大.本试验获得的最佳摇瓶发酵配方为:玉米粉4%、黄豆饼粉1%、酵母粉2%、鱼粉2.5%和蛋白胨0.1%(质量分数).     

实时定量PCR测定苏云金芽胞杆菌质粒pBMB67的拷贝数

根据苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520的全基因组测序结果,在内生质粒p BMB67和染色体上分别选取单拷贝片段,利用实时荧光定量PCR法测得质粒p BMB67的拷贝数为21。此外,在内生质粒p BMB67的3个不同位点设计引物,分别以不同的靶片段作为实时荧光定量PCR的检测对象,测得p BMB67质粒的拷贝数分别为20.1、21.0和21.3,表明单拷贝靶片段的选择对测定质粒的拷贝数没有影响,进一步证明了实时荧光定量PCR测定质粒拷贝数的可行性。