蚊虫乙酰胆碱酯酶的真核表达、纯化及活性测定

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶真核表达载体构建及在293T细胞中表达条件

乙酰胆碱酯酶(AChE;EC 3.1.1.7)是神经传导中调节神经递质乙酰胆碱水平的一种关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标。目前关于朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的真核表达还未见报道。本研究拟构建朱砂叶螨AChE的真核表达载体,进行在293T细胞中表达条件摸索。将朱砂叶螨野生型ace完整读框和去掉3’疏水区的ace基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,经PCR和双酶切鉴定及测序验证后,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/ace。采用GFP报告基因确定在293T细胞中表达条件摸索,结果表明293T细胞的最适转染时间为48h和LipofectamineTM2000转染试剂的最适加样量为20μL。本试验成功构建了朱砂叶螨AChE的真核表达载体,确定了在293T细胞中的表达条件,为后续筛选新型选择性AChE抑制剂奠定了基础。     

云南烟蚜羧酸酯酶活力测定条件的研究

 比较5种α-乙酸萘酯羧酸酯酶活力测定方法,发现唐振华等（1988）方法较好。进一步以底物浓度、反应温度、温浴时间、pH作因子,采用正交设计的方法来确定α-乙酸萘酯羧酸酯酶活力测定的最佳条件,结果表明,除pH影响不显著外,其余3个因子均影响显著吸光值,其中底物浓度影响极显著。4因子的主次关系为:底物浓度＞反应温度＞温浴时间＞pH。测定云南烟蚜的羧酸酯酶活力时,以底物浓度6.0×10^-4 mol/L,缓冲液pH 8.0,37 ℃保温30 min组合较好。     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其酶活测定条件优化

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标。现研究拟采用发酵罐培养含pET-30a/ace的表达菌株E.coli BL21(DE3),大量表达纯化螨AChE,利用单因素试验和正交试验优化AChE活性的测定条件。结果表明:发酵培养的重组菌株大量表达约为68kD的朱砂叶螨AChE蛋白。底物浓度、温度、pH和酶浓度等各测定因素对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性存在显著影响。确定朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性测定的最佳反应条件为:底物浓度1mmol/L,pH值7,温度35℃,酶浓度0.5mg/mL。通过体外发酵培养纯化获得了大量的朱砂叶螨AChE重组蛋白,确定了螨AChE活性测定的最佳条件,为进一步研究其酶学性质以及AChE抑制剂的体外筛选奠定基础。     

昆虫杆状病毒表达系统在禽流感病毒研究中的应用

禽流感的防控,主要在疫苗的免疫和平时的监测以及发病后的快速诊断等多个方面采取综合措施才能取得较好效果,这就需要建立快速、特异的诊断、检测方法以及不断开发新型疫苗用于禽流感的免疫。昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)因具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,现已成功表达了近千种高价值蛋白。其在禽流感病毒中的应用,为禽流感防控所需的特异性抗原,诊断、检测方法的建立,新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

重组H5N1亚型禽流感病毒NA基因腺病毒的滴度测定及遗传稳定性研究

为了研究表达H5N1亚型禽流感病毒NA基因重组腺病毒pAdN1的遗传稳定性及重组病毒的滴度,将重组腺病毒pAdN1在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15、20代的重组病毒,采用PCR 方法扩增禽流感病毒NA基因,并进行基因序列分析;用绿色荧光蛋白做标记计算出20代次时重组病毒的滴度.结果显示:从各代重组病毒DNA 中均扩增出了约1 400 bp的目的条带,序列分析结果表明,第5、10、15代重组病毒中的NA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有2处发生了点突变(516位A→G,1 323位T→C),但其编码的氨基酸未发生变化,即蛋白抗原表位未发生变化;采用快速测定法计算出重组腺病毒的滴度为109.5 pfu/mL.     

荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的研究与应用

利用常规PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2保守区域276 bp片段,将其克隆到pMD-18载体,以pMD-18T-276质粒DNA作为标准质粒模板优化反应条件,建立定量检测PCV2的荧光定量PCR方法.结果表明:Ct值与标准品模板在5.60×101～2.74×109拷贝·μL-1范围内呈良好的线性关系,相关...     

植物酯酶源的筛选及最佳提取条件的确定

为建立蔬菜、水果中农药残留的快速检测方法,以2,6-二氯乙酰靛酚为显色剂,对不同来源的植物酯酶进行筛选,以总酯酶活力和比活力为考核指标,确定最佳植物酯酶源。结果表明:苜蓿酯酶的活力和比活力最大,苜蓿为最佳植物酯酶源,酯酶最佳提取条件是在4℃,以pH7.0的0.1mol·L-1磷酸盐缓冲溶液为提取剂,料液比1∶10,提取时间10min。     

枸杞果胶酯酶基因LbPME克隆及表达分析

以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)'宁杞1号'果实为材料,利用RT-PCR技术,克隆出LbPME的全长序列为1152 bp,包含完整的开放阅读框(ORF),编码有384个氨基酸,蛋白质分子量为42.63 ku,理论等电点9.20;LbPME编码的蛋白包含2个可能的N-糖基化结合位点(Asn46和Asn1...     

口蹄疫病毒VP31基因在昆虫细胞中的表达

研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达.     

蝉拟青霉酯酶的产酶条件优化

为获得蝉拟青霉酯酶酶活较高的菌株及其高产量的蝉拟青霉酯酶,对8株蝉拟青霉胞内酯酶进行活力测定,从中筛选出酶活力高的菌株为GZDXIFR4611,并对其进行产酶条件的研究.结果表明,GZDXIFR4611产酯酶的最佳液体发酵培养基组成为可溶性淀粉10 g/L,酵母膏7.5 g/L,K2HPO40.35 g/L,MgSO4·7H2O 0.35 g/L.酯酶在48 h产量最高,酯酶的最适反应温度为40℃,最适pH为6.5,最适反应时间为40 min,在25℃条件下半衰期约为58 h,在40℃时稳定性最高.     

苏铁共生蓝细菌PCR条件的优化

在研究苏铁共生蓝细菌的种群多态性过程中 ,为了直接以极少量的新鲜蓝细菌为PCR反应模板 ,对 5种抗抑制剂进行了一系列优化组合方案的试验 ,并对比了 3种循环参数 ,发现在 2 5 μL标准反应液基础上加有 3.75 μL 10 %BSA和 2 μL 10 %DMSO ,退火温度为 5 6℃时效果最佳。     

研究土壤微生物多样性的PCR条件优化(英文)

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

木质素合成酶COMT基因的PCR扩增条件优化

以2×CTAB法从欧美杨107号嫩叶提取的基因组DNA为试材,建立了木质素合成酶COMT基因的PCR扩增体系。通过对PCR反应的影响因子——模板DNA用量、dNTP浓度、DNA聚合酶量、引物浓度和退火温度进行优化,最终建立了扩增COMT的PCR优化体系为:在20μL的反应体系中,dNTP为2.5 pmol,引物各为5 pmol,模板为5 ng,Red TaqTMDNA聚合酶1.25 U,退火温度为51℃,可以扩增出清晰的扩增带。     

Vero细胞体外培养条件的优化

为了优化一种适合Vero细胞体外快速生长,且生长状态良好的培养条件,笔者对比了2种不同培养条件下的细胞生物学观察结果,Vero细胞经台盼兰活体染色,改进培养条件后细胞活体率为97.8%,比原始培养条件下活体率明显增高,且该方法具有简便、易行、成本低等优点,值得进一步推广应用。     

大红火龙果花粉离体萌发条件的优化及其活力测定方法筛选

为大红火龙果人工授粉及其丰产栽培、杂交育种及果实品质改良提供参考,采用单因素试验,研究不同培养基组分对花粉萌发的影响,并运用离体萌发法测定花粉萌发率;比较TTC染色法、醋酸洋红染色法、亚历山大红染色法和I₂-KI染色法测定大红火龙果的花粉活力,筛选准确测定大红火龙果花粉活力的最佳方法。结果表明:大红火龙果花粉离体萌发最佳培养基组分为Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.3g/L+MgSO₄·7H₂O 1.2g/L+KNO₃ 0.1g/L+15%蔗糖+700mg/L硼酸+1%琼脂,pH为6.7,此条件下花粉萌发率高,为(43.9±6.27)%,且利于花粉管伸长。醋酸洋红法测定的大红火龙果花粉活力为(37.67±4.18)%,与离体萌发法测定的萌发率无显著差异,为花粉活力的最佳测定方法。     

城市生活垃圾中木质素含量测定方法的优化

[目的]为更有效地处理生活垃圾提供参考。[方法]采用硫酸法测定生活垃圾中的木质素。以垃圾中脂肪抽提时间、硫酸浓度、水解反应温度、水解反应时间、加水稀释硫酸浓度、回流时间为考察因素进行6因素5水平正交试验。[结果]测定生活垃圾中木质素含量时各因素影响大小为：回流时间〉水解反应温度〉硫酸浓度〉脂肪抽提时间〉水解反应时间〉加水稀释硫酸浓度。测定生活垃圾中木质素含量的最佳条件为：脂肪抽提时间1h、硫酸浓度60%、水解反应温度20℃、水解反应时间1h、加水稀释硫酸浓度9%、回流时间3h。优化后木质素的测定条件RSD均小于1.51%,表明该方法的精度高,适用于垃圾填埋各个阶段的木质素含量测定,且分析结果准确可靠,符合分析方法的要求。[结论]优化了城市生活垃圾中木质素含量的测定方法。     

龙葵碱提取条件优化及其含量的测定

[目的]测定并比较龙葵不同部位中龙葵碱的含量。[方法]采用乙醇一乙酸提取法对龙葵不同器官中的龙葵碱进行对比提取试验,采用吸光度法进行生物碱含量测定,并对不同器官的生物碱含量进行对比分析。[结果]茎中龙葵碱的含量为0．06％,叶中含量为0．19％,未成熟的果实中含量为0．33％,成熟的果实中的含量为0．06％。龙葵碱含量在植株各部位的大小顺序为：茎〈成熟果实〈叶〈未成熟果实。[结论]该方法优化了龙葵碱的提取条件,为龙葵碱的工业化生产提供了理论依据。     

用于荔枝qPCR分析的内参基因克隆及稳定性分析

利用基因克隆和测序,从‘妃子笑’荔枝果皮中获得了β-Actin、GAPDH和18S rRNA 3个qPCR分析常用的内参基因全长序列,其长度分别为1 273、1 368和1 712 bp;3个基因与其他物种高度同源,氨基酸序列相似性均超过了98%.在此基础上,结合已报道的UBQ、eEF和25S rRNA 3个常用的内参基因,对β-Actin、GAPDH、18S rRNA,UBQ、eEF和25S rRNA 6个常用内参基因在荔枝果实发育不同阶段和外源生长调节剂处理后表达稳定性进行了分析,同时比较了geNorm、Norm Finder和BestKeeper 3种不同算法的差异.结果表明:以上6个基因中,β-Actin基因在3种不同算法下均保持了较好的表达稳定性.     

薄层色谱法检测大豆皂苷的条件优化

为了建立一种薄层色谱(TLC)法定性检测大豆皂苷的最适方法,试验对TLC法检测大豆皂苷的展开剂配比、展开时间、点样量、展开温度、预饱和时间以及显色条件进行了优化。结果表明,使用薄层色谱法检测大豆皂苷的最适条件:展开剂为氯仿∶甲醇∶水∶甲酸=65∶38∶10∶0.01(体积比),展开时间70 min,点样量10μL,展开温度30℃,预孢和时间30 min,在10%的H_2SO_4溶液中浸泡3 min。在此条件下,对20个大豆材料皂苷类型进行了分析,发现晋大53和SNWS47为Ab型,其余均为Aa型。该方法可以准确检测大豆皂苷类型,并适用于不同大豆材料大豆皂苷组成的分析,为今后大豆皂苷特异种质的筛选和改良提供技术基础。