苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的功能鉴定

【目的】探究苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的性质及其生物学功能。【方法】利用PCR技术得到MDP0000235230(Md6PGDH6)基因的全长,进行相关生物信息学分析,利用qRT-PCR技术研究其时空表达模式,利用农杆菌介导的转化方法获得Md6PGDH6转基因‘王林’愈伤组织,以及异源表达Md6PGDH6基因的拟南芥和烟草。【结果】MDP0000235230基因与拟南芥AT4G29120.1(At6PGDH6)归为一类,将MDP0000235230命名为Md6PGDH6基因。Md6PGDH6基因包含一个942 bp开放阅读框。在线网站预测发现,Md6PGDH6蛋白整体表现为亲水性。启动子分析发现,其含有分生组织、激素响应、环境因子和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md6PGDH6基因在茎、果皮、果肉和种子中表达量较高,在根、叶和花中表达量较低。Md6PGDH6基因促进‘王林’愈伤组织、拟南芥和烟草的生长。【结论】Md6PGDH6在果肉中表达量较高,Md6PGDH6基因有助于‘王林’愈伤组织的生长。     

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。     

枣甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

以‘金丝小枣’为试材,根据GAPDH基因保守序列设计引物,采用同源克隆和RT-PCR法,克隆枣GAPDH基因并进行生物信息学及转录表达分析。结果表明:该基因包含完整的开放阅读框为1 020bp,编码339个氨基酸残基,预测分子量为36.904kDa,理论等电点为8.53,命名为ZjGAPDH(KP147910);该蛋白包含2个保守结构域,即Gp_dh_N superfamily和Gp_dh_C superfamily;系统进化树分析表明,ZjGAPDH与其它物种GAPDH蛋白的同源性相对较小,但均属于存在细胞质中参与糖酵解过程的蛋白;实时荧光定量分析表明,ZjGAPDH基因在枣果实不同发育时期中表达有显著差异,在幼果期和全红期果实中的表达丰度较高。     

甜瓜属人工异源四倍体与栽培黄瓜渐渗杂交及其后代遗传变异研究

 以甜瓜属人工异源四倍体(Cucumis ×hytivus Chen and Kirkbride, 2n = 38) 与华南和华北两种生态型栽培黄瓜(C. sativus L. , 2n = 14) 进行杂交, 比较各个杂交组合的坐果率及结籽率情况, 并通过形态学和分子标记的方法研究这些后代群体的遗传变异。结果表明, 各种杂交组合的坐果率达到83% ～100% , 其中以异源四倍体×栽培黄瓜获得含有胚的果实比例较高, 为60% ～67% , 平均每个果实中约有10～20个胚, 通过胚胎拯救, 成活率接近100% , 染色体计数为26条, 为异源三倍体。在以栽培黄瓜×异源四倍体的杂交中, 获得3个果实, 其中1个果实含有大约180个胚, 胚胎拯救成活率接近80% , 染色体数为26条, 为异源三倍体; 另外2个果实分别含有60粒和15粒种子, 植株染色体数为14条, 与栽培黄瓜相同。异源三倍体与栽培黄瓜间杂交产生的含有胚或种子的果实极少。选择其中1个异源四倍体×栽培黄瓜后代含14条染色体的群体(HH1群体) 深入研究, 有4株表现野生种C. hystrix的多分枝习性, 6株的果刺颜色表现野生种C. hystrix的黑色性状, 且其果皮成熟颜色均为橘红色, 不同于两个原始亲本。通过SSR和RAPD两种标记对HH1 群体的遗传研究, 19 个SSR 标记共产生63 个等位基因, 其中24个(约38.1% ) 表现出变异, 有7个等位基因可能来自于野生种C. hystrix。在400余条随机引物中, 有24条引物产生变异位点, 在统计的186个位点中, 有56个(31.7% ) 位点出现遗传分离, 其中8个位点可能来自于野生种C. hystrix, 这表明通过远缘杂交及渐渗杂交过程可将野生种的基因导入栽培黄瓜中。     

黄瓜CsaDMR6-2基因的克隆及特征分析

通过系统进化树和黄瓜霜霉病主效QTL分析,确定了与拟南芥抗霜霉病突变基因DMR6同源性较高的Csa DMR6-2基因为黄瓜霜霉病感病候选基因。以15份不同遗传背景的抗病和感病黄瓜自交系为材料克隆了Cs DMR6-2基因,经过与已知功能的拟南芥基因DMR6、DLO1和DLO2的氨基酸进行多序列比对、蛋白质二级和三级结构的预测,结果显示:欧洲温室型的抗病材料K15和K58的Csa DMR6-2的CDS序列在856bp处有1个碱基的突变,引起相应氨基酸由丝氨酸(TCA)变成丙氨酸(GCA),进而引起其部分蛋白质二级和三级结构的变化;Csa DMR6-2与拟南芥的DMR6、DLO1和DLO2基因具有很高的同源性,且同属于一类氧化酶,两者具有相同的结构域,而抗病材料的变异位点均发生在催化区。试验结果为进一步研究Csa DMR6-2的基因功能和利用感病基因获得霜霉病持久广谱抗性打下了良好的基础。     

植物△6-脂肪酸脱氢酶及其基因的研究进展

包括γ-亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸在生物系统中具有广泛的功能,对人类健康有着非常重要的作用。而Δ6-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶,现从Δ6-脂肪酸脱氢酶的分类地位、基因克隆及表达、结构功能和系统进化等方面介绍了Δ6-脂肪酸脱氢酶的研究进展。     

黄瓜ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA的克隆及表达

 利用cDNA末端快速扩增技术, 从黄瓜叶片组织中获得脂肪酸去饱和酶基因（Cs-FAD）,其序列长度为1 807 bp,编码445个氨基酸,推导的氨基酸序列与已经报道的ω-3脂肪酸去饱和酶基因序列同源性较高,与桃果实的同源性最高（77%）。利用RT-PCR半定量分析显示,该基因在绿色组织如茎、叶、卷须里表达量较高,在根、花、果实及种子里也有少量表达。     

黄瓜钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK5的克隆及响应淹水胁迫的表达分析

通过对黄瓜耐涝品系Zaoer-N和不耐涝品系Pepino淹水处理72 h后发现,Zaoer-N下胚轴平均可生成24.6条不定根,而Pepino平均仅能生成1.5条不定根,两者差异显著。从上述两个品种中克隆了钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK5的全长,两者序列完全一致,全长均为1 887 bp,编码629个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为59.17 k D,理论等电点为5.65。亚细胞定位预测表明CsCDPK5定位于细胞质。Zaoer-N和Pepino启动子相似度为99%,有14个碱基位点的差异,两者均含有与激素信号及低氧胁迫响应相关的顺式作用元件,而诱导子激活元件AT-rich sequence和功能未知元件F-box为Zaoer-N所特有的启动元件。qRT-PCR结果表明:(1)CsCDPK5在黄瓜下胚轴中的表达量最高;(2)淹水条件下,Zaoer-N和Pepino下胚轴中CsCDPK5的相对表达量均呈现先上升后下略有降,之后又上升的趋势,且Zaoer-N中的表达量大于Pepino;(3)根和叶中CsCDPK5的相对表达量无明显规律性;(4)在使用乙烯竞争性抑制剂1-MCP预处理后,淹水条件下Zaoer-N下胚轴不定根形成被抑制,CsCDPK5的表达与非淹水对照亦无明显差异。综上所述,黄瓜CsCDPK5为淹水胁迫响应基因,可能参与黄瓜淹水后下胚轴不定根的形成过程。     

黄瓜液泡膜H+-PPass基因CuPPase的cDNA克隆、序列分析与表达

 利用GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜H⁺-PPase 基因,命名为CuPPase,GenBank 注册号为GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高,分别为94%,92%。生物信息学分析表明,该基因全长2 650 bp,开放阅读框（ORF）2 307 bp,编码768 个氨基酸;CuPPase 蛋白大小约80 kD,理论pI值为5.32。该基因有14 个强的跨膜螺旋结构,PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明,CuPPase 在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导,但与处理时间有密切关系,其表达均表现先升高后降低的趋势。     

蝴蝶兰多酚氧化酶基因克隆及序列分析

 利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰中克隆的多酚氧化酶同源基因, 命名为PhPPO, 其cDNA 全长1 851 bp, 完整的编码框长1 647 bp, 编码549个氨基酸, 生物信息学分析表明其具有酪氨酸酶家族的特征, 具有保守的CuA 和CuB 结合区, 以及向叶绿体运输的导肽结构。将其亚克隆到表达载体pPRoEXHTa上, 在BL21 (DE3) 进行表达, 经ITPG诱导, 获得蝴蝶兰PPO原核表达蛋白。     

牡丹泛素延伸蛋白基因ubiquitin克隆及其作为内参基因的研究

以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa‘Luoyanghong’）为试验材料,采用RT-PCR方法获得一个牡丹泛素延伸蛋白基因Psubiquitin（PsUBI）,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为447 bp,编码148个氨基酸,GenBank登录号为KP742952。序列比对发现,该基因与其他23种植物泛素延伸蛋白核苷酸序列的相似性均在81%以上,氨基酸序列的相似性达96%。进化分析表明,牡丹泛素延伸蛋白与棉花泛素延伸蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,在牡丹不同组织器官中,相对于其他5个常用看家基因（GAPDH、GAPDH1、tubulin、tubulin2、18S rRNA）,ubiquitin的PCR扩增曲线的CT值最为恒定,尤其是在不同花器官中的CT值完全一致。进一步分析发现该基因在牡丹的根、茎、叶片、花、雄蕊和心皮组织中均恒定表达,特别是花器官中的表达量几乎完全一致。以ubiquitin作为内参基因探讨控制花器官发育的基因PsAG的表达情况,结果显示PsAG的表达模式与其作用位点相吻合,ubiquitin更适宜作为牡丹花器官研究的内参基因。     

黄瓜果实苦味基因Bt的初步定位

 以果实无苦味的黄瓜纯合自交系931（btbt）和果实有苦味的纯合自交系46GBt（BtBt）为亲本构建的含有184个单株的F2群体为试材,对其进行SSR标记遗传连锁分析,构建了Bt基因的SSR连锁群。该连锁群包含8个SSR标记,与Bt基因最近的两侧标记为SSR10795和SSR07081,遗传距离分别为0.8 cM和2.5 cM。经验证,两标记检测的正确率均为91.6%。通过与前人发表的高密度图谱比较,将Bt基因定位在黄瓜第5染色体短臂一端3.3 cM范围内。利用黄瓜全基因组测序提供的基因预测、注释结果,发现与Bt基因紧密连锁的两个标记SSR10795和SSR07081之间的物理距离为17 227 kb,在该区域中共预测了536个候选基因。     

芋淀粉分支酶SBE基因的克隆与表达分析

以多子芋品种‘香堂芋’幼嫩叶片为试材,利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长为3 051 bp的淀粉分支酶SBE基因cDNA序列（登录号：KX013544）,其中开放阅读框长2 538 bp,编码845个氨基酸;该序列与玉米SBEII、马铃薯SBEIIa同源性均达85%以上;芋SBE编码蛋白具有N–末端、C–末端和α–淀粉酶催化域。利用RT-PCR技术克隆得到芋SBE的基因组DNA序列,全长为12 362 bp,包括20个外显子和19个内含子。芋球茎形成过程中,子芋植株叶片中SBE表达量显著高于母芋植株叶片、叶柄和根系及母芋等组织,子芋膨大过程中SBE表达量逐渐升高,而孙芋膨大过程中SBE表达量逐渐下降。子芋、孙芋SBE表达对支链淀粉合成积累可能起重要作用。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。