应用间接荧光抗体法检测IgG抗体诊断马传贫的研究

应用间接荧光抗体法(IFA)检测114匹份补体结合反应(CF)或琼脂扩散反应(ID)阳性马、骡血清,结果全为阳性,而单用CF和ID,其阳性率分别为47.4％和71％;检测1000匹份健康马骡和27匹份类症病马血清,结果全为阴性。在传贫检疫中,同时以ID和IFA对3625匹马、骡血清进行检测,结果IFA多检出4匹。对此4匹马、骡经多次用CF追试,其中3匹为阳性,1匹经调查曾注射疫苗,未再继续追试。应用上述三种方法对100匹注射疫苗的马、骡、驴的抗体阳性率进行了测定,结果IFA44％,CF25％,ID％。IFA法最终判定以需2小时,节省抗原材料,具有快速、简便的优点。     

猪蓝耳病活疫苗中猪瘟外源病毒检测

试验采用IFA法对2批随机抽样的PRRS活疫苗(每批4瓶)、阳性对照(CSFV)、阴性对照(未被CSFV污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV))和特异性试验检测病毒(猪圆环病毒2型(porcine circo virus 2 type,PCV-2))接种于生长良好的PK-15细胞进行间接免疫荧光染色检测CSFV,以期建立快速、准确的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)调查猪蓝耳病活疫苗中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的污染情况;在不同时间、相同试验条件下,相同批次的疫苗被重复检测了3次。试验结果表明:阳性对照接种的PK-15细胞出现特异性黄绿色荧光,阴性对照、PCV-2和待检样品接种的PK-15细胞均未出现特异性黄绿色荧光,即待检2批PRRS活疫苗未被CSFV污染;通过3次重复操作,最终的检测结果一致,说明IFA检测猪瘟病毒包涵体的特异性强、敏感性高。     

间接荧光抗体试验诊断马骡伊氏锥虫病的研究

以人工感染伊氏锥虫的小鼠血液涂片为抗原,建立了IFA试验检测马骡伊氏锥虫抗体的方法,并对伊氏锥虫病马、同群马、健康马、非伊氏锥虫病马血清作了检测。伊氏锥虫病马和无症状同群马的抗体阳性率分别为97％(33/34)和12％(18/150);25匹健康马血清伊氏锥虫抗体均为阴性;84份非伊氏锥虫病马血清的IFA试验均为阴性,未出现交叉反应。多数病马发病一周内的血清IFA试验即为阳性。3匹病马血清抗体消长动态观察结果表明,病马于治疗后110天,血清IFA试验仍为阳性。本试验表明,IFA试验检测马骡伊氏锥虫抗体,敏感性高、特异性强,对无症状的感染马也能检出,可用于本病的早期诊断和血清流行病学调查。     

基因C型鸭甲肝病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

为建立基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)间接免疫荧光检测技术(IFA),本研究以纯化的DHAV-C单克隆抗体(MAb)为一抗,FITC标记的兔抗鼠Ig G(Ig G-FITC)为二抗,建立了DHAV-C IFA检测方法。该方法仅对感染DHAV-C的肝组织触片检测为阳性,而对分别感染基因A型鸭甲肝病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭源金黄色葡萄球菌、鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的SPF鸭肝组织触片检测为阴性,表明该方法特异性好;重复性试验表明,该方法批内和批间重复性好。一抗和二抗在-20℃至少能保存7个月。实验感染SPF雏鸭IFA和RT-PCR检测符合率100%。本研究建立的DHAV-C IFA方法特异性好,可以用于该病毒感染肝组织的快速检测。     

消灭种公羊布鲁氏菌病的报告

本文报告了消灭公羊群(64只)自然感染绵羊布鲁氏菌病的方法。用补体结合(CF)试验对18只有附睾炎的公羊进行了检测,所有的羊出现阳性或可疑。另对20只羊进行了CF试验,对其中14只羊进行了精液培养,并全部分离出绵羊布鲁氏菌。在这20只羊的CF检查中,2只呈阴性结果,而酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断和精液培养证实为布病阳性。建议在诊断羊布鲁氏菌病时,除了采用CF试验和体检外,还应使用ELISA诊断。采用综合诊断方法对于提高绵羊布鲁氏菌感染的早期诊断具有重要意义。     

抗猪瘟病毒单链抗体的原核表达及活性鉴定

为了制备抗猪瘟病毒(CSFV)单链抗体(scFv)并鉴定其生物学活性,试验以编码特异性抗CSFV scFv基因序列为基础,按照大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成scFv基因,将其克隆入pCzn1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行Ni-IDA亲和层析纯化、SDS-PAGE检测和Western-blot鉴定,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA验证蛋白抗原的活性。结果表明:密码子优化合成的抗CSFV scFv基因全长768 bp,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,其分子质量约28.0 ku,Western-blot检测显示纯化后的目的蛋白能被抗His标签单克隆抗体特异性识别,IFA和ELISA检测证实纯化复性后的蛋白可与CSFV发生特异性结合反应,且存在明显的浓度依赖性。说明应用原核表达系统可高效制备抗CSFV scFv。     

犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

本试验采集宁夏地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便拭子,经过预处理后同步接种胎猫肾细胞(FK81),盲传3代后发现FK81细胞出现明显的细胞毒性改变(CPE)。冻融收获病毒后,对分离出来的病毒进行电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)检测、特异性PCR鉴定及VP2全基因序列扩增分析,成功分离培养出1株犬细小病毒(CPV)。     

猪瘟兔化弱毒间接免疫荧光鉴定方法的建立

为快速有效测定猪瘟疫苗病毒含量,建立了猪瘟兔化弱毒(HCLV)间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与兔体定型热试验方法进行了初步比较。试验结果表明,以冷甲醇固定ST细胞,将所选猪瘟活疫苗检验用阳性血清1:40倍稀释、荧光二抗1:32倍稀释时,IFA检测HCLV感染的ST细胞清晰、特异,检测猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒感染细胞阴性。对不同猪瘟疫苗半成品的检测结果显示,IFA测定半数组织感染量(TCID50)与兔体定型热试验测定兔体感染量(RID)具有较好的相关性,其拟合曲线为RID/m L=2.783TCID50/m L+110107.213。     

犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定

采集疑似细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(F81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为HZ0761。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPV VP2基因的特异性片段(221 bp);病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶28,其血凝性能被特异性抗体抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光;电镜观察感染的F81细胞核内可见20 nm左右的病毒颗粒;病毒液的TCID50为10-4.8/mL,VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2 a型。     

广西优势血清西优势血清型IBV代表株M基因在杆状病毒系统中的表达

采用RT-PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的膜(M)蛋白基因,将其克隆至pFastBac~(TM)/HBM-TOPO杆状病毒转移载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rHBM-M;将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定表达的M蛋白。IFA检测可见重组杆状病毒感染后72h细胞出现特异性荧光,Westernblot检测可见大小约为26ku的特异性蛋白带,表明该重组M蛋白在Sf9昆虫细胞中成功获得表达。研究为IBVM蛋白的生物学功能、IBV诊断试剂和新型疫苗制备等奠定基础。     

非洲猪瘟病毒CP312R蛋白的真核表达及单克隆抗体制备

为制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CP312R蛋白的单克隆抗体,以真核表达ASFV的CP312R蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并通过间接免疫荧光法(IFA)对获得的单克隆抗体进行反应性鉴定。结果利用杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, BES)构建获得重组转移载体pOET3-CP312R,与杆状病毒基因组flashBAC^TM ULTRA共转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒AcMNPV-CP312R,且该病毒以胞内可溶形式表达出重组ASFV CP312R蛋白质。通过蛋白质印迹法鉴定显示重组CP312R蛋白可以与ASFV阳性血清发生特异性反应。此外,筛选获得2株针对重组CP312R蛋白的单克隆抗体(McAb),间接ELISA方法鉴定抗体滴度不低于1∶1 024 000。IFA试验检测表明,单克隆抗体与非洲猪瘟抗原发生特异性反应。本研究为非洲猪瘟亚单位疫苗研发及血清学检测方法的建立提供物质储备。     

血凝和血凝抑制试验影响因素的分析

<正>血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验是利用某些病毒具有凝集红细胞的特性,且这种特性能被特异性抗血清抑制的原理,用于已知病毒检查血清中相应抗体状态和已知血清鉴定未知病毒的一种兽医实验室最常用的实验方法。     

J-亚群禽白血病病毒中国广东野毒株的分离与鉴定

通过接种鸡胚成纤维细胞、间接荧光抗体试验(IFA)和聚合酶链式反应(PCR)从疑似J-亚群白血病的病鸡中,分离鉴定出J-亚群白血病病毒。抗J-亚群白血病病毒gp85单克隆抗体JE9的IFA试验和PCR试验均证明病鸡被J-亚群白血病病毒感染。     

J-亚群禽白血病病毒中国广东野毒株的分离与鉴定

通过接种鸡胚成纤维细胞、间接荧光抗体试验(IFA)和聚合酶链式反应(PCR)从疑似J-亚群白血病的病鸡中,分离鉴定出J-亚群白血病病毒.抗J-亚群白血病病毒gp85单克隆抗体JE9的IFA试验和PCR试验均证明病鸡被J-亚群白血病病毒感染.     

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

诊断牛副结核病的三种血清学试验与粪便培养结果比较

从已知感染副结核分枝杆菌的13群牛(192头)中采集的粪便和血液样品做了补体结合试验(CF)、琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)和酶标记免疫吸附测定(ELISA)三种副结核血清学诊断比较。从36头牛的粪便中分离出了副结核分枝杆菌,23头粪便培养阳性牛 CF 试验的滴度出现疑似或阳性,10头 AGID 试验阳性及     

鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定

将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin 18,mChIL-18)基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌中高效表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb),并通过间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)和Western blot等方法对mAb做初步鉴定.结果表明,试验成功表达了mChIL-18蛋白,并获得2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(1G9、2E6),其腹水ELISA效价分别为1∶5.12×10 5和1∶3.2×104,亚类鉴定结果均为IgM.Western blot结果显示,2株单抗均能特异性识别原核表达的mChIL-18蛋白,IFA分析表明它们均能与真核表达的mChIL-18发生特异性反应,ELISA叠加试验证实1G9与2E6针对2个不同的抗原表位.本研究所获单抗可以用于建立鸡IL-18的检测方法,为进一步开展其生物学功能研究奠定了基础.     

猪伪狂犬病病毒HeN1株gE蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E(gE)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以原核系统表达PRV HeN1株截短的gE(aa127~aa232)蛋白(rgE),并对表达的rgE进行纯化免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,以该病毒感染的Vero E6细胞及真核表达的gE蛋白为检测抗原,采用IFA检测方法筛选杂交瘤细胞系,获得一株稳定分泌抗PRV gE的MAb杂交瘤细胞系(mgE185)。该MAb亚型鉴定为Ig G1型,轻链为Κ链。该MAb不具有中和病毒的活性,其细胞培养上清及腹水IFA效价分别为1∶80和1∶2 560。Western blot试验显示mgE185可以特异性识别gE蛋白,表明其针对的抗原表位为线性表位。通过截短表达gE蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为~(151)IGDYL~(155),该抗原表位在PRV中高度保守。本研究制备的MAb为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRV gE-ELISA检测方法奠定了基础。     

一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107～aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

鸡马立克氏病病毒(MDV)单克隆抗体(McAb)的研究——Ⅰ.抗血清Ⅰ型MDV-McAb的制备及其主要特性的研究

将MDV京-1株强毒高温致弱毒株(B-1/at)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物经冻融、超声波裂解和差速离心制成粗提高毒抗原,免疫6～8周龄雌性BALB/C小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,融合率为66％。用间接免疫荧光(IFA)法和间接ELISA法进行筛选,结果阳性率为25％,特异性阳性率为10.7％。通过有限稀释法克隆出D_(11)~3、D_(12)~3、和H_9~3三个分泌抗血清Ⅰ型MDV的McAb杂交瘤细胞株,其核内染色体数D_(11)~3为103±6条,D_(12)~3为96±6条,分泌的抗体均为IgG_1,k链。琼脂扩散试验(AGP)表明,无论有无聚乙二醇(PEG6000)存在,这些McAb均不产生特异性沉淀线,其IFA阳性反应能被特异性阳性血清阻断,经IFA、ELISA试验、IFA吸收试验和IFA、ELISA阻断试验等证明,这些McAb只与血清Ⅰ型MDV反应,不能与血清Ⅱ型MDV、血清Ⅲ型HVT和鸡的多种其它病毒发生交叉反应,也不与猪伪狂犬病病毒(Prv)双城株发生交叉反应,D_(12)~2株McAb有较明显的中和活性。经体内、外连续传代和冻存、复苏,两株细胞的分泌抗体能力稳定,