濒危药用植物沙冬青内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

为探明濒危药用植物沙冬青内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行了分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果显示,从沙冬青不同组织器官中分离出41株内生真菌,根部最多,其次为叶部,茎部最少,经形态学初步分类鉴定归于5个目,6个科,19个属;有31株菌对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的75.6%,15株内生真菌对1种或多种供试细菌指示菌具有不同程度的抑制作用,占分离菌株总数的36.6%,其中5株内生真菌分别对4种植物病原真菌指示菌具有明显的抑制作用,占菌株总数的12.2%,8株内生真菌对1种供试细菌指示菌有明显的抑制作用,占分离菌株总数的19.5%, 4株内生真菌菌株即对供试植物病原真菌指示菌又对供试细菌指示菌有明显抑制作用, 抑菌范围宽,属于青霉属、束丝菌属、茎叶核菌属。濒危药用植物沙冬青具有丰富的内生真菌资源,其开发和利用具有重要的生态学意义和经济价值。     

大兴安岭森林凋落物真菌及其次生代谢物活性

【目的】研究旨在得到大兴安岭林下凋落物中具有活性的新型真菌资源。【方法】利用颗粒法分离森林凋落物中的可培养真菌进行。利用真菌的内部转录间隔区序列对分离到的真菌进行分子生物学鉴定。利用两种方法进行对新颖的真菌进行发酵与次生代谢物粗提物的制备。通过双层平板药剂扩散法与薄层层析清除DPPH自由基法分别测试粗提物的活性。【结果】分子鉴定结果表明分离培养了40株凋落物真菌,它们隶属于35个属,38个分类单元,其中6株真菌为疑似真菌新种。来自2株真菌的2个提取物展现了抗细菌活性。尤其是Parapyenchaeta属新种LB0026号菌株具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性,对供试革兰氏阴性细菌未展现明显活性。另外还有2株真菌的2个提取物展现了清除DPPH自由基活性。这两个提取物分别含有2个和3个抗氧化化合物。【结论】大兴安岭林下凋落物中,可培养真菌种类丰富,其中有四株新型真菌具有明显的抗菌活性或抗氧化活性,值得深入研究。     

蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌IAA细菌的筛选

为从蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)根部分离出可分泌吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)的内生细菌,通过探讨蝴蝶兰根部表面消毒的最佳条件,采用分离培养法、生理生化实验和16S rDNA分析,对蝴蝶兰根部出内生细菌进行研究。结果表明,NA培养基分离出的6株细菌分别属于短杆菌属(Brevibacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Dyella和类芽胞杆菌(Paenibacillus);R2A培养基分离出的20株细菌分别属于伯克氏菌属(Burkholderia)和Dyella;分离获得的26株内生细菌中,具有分泌IAA的功能有23株,占分离总菌数的88.5%。综合来看,蝴蝶兰根中存在可分泌IAA不同种属的内生细菌,为进一步研究内生细菌与蝴蝶兰植物之间的相互作用提供了菌种资源。     

盐碱地引种沙枣根瘤内生菌及根际土壤AM真菌的多样性

为了揭示黑龙江省盐碱地引种沙枣根瘤内生菌及根际土壤丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌的多样性,采用根瘤切片法和湿筛法并结合分子生物学手段对沙枣根瘤内生菌及根际土壤中的AM真菌进行分离、鉴定和多样性分析。研究结果表明:从沙枣根瘤内成功地分离和鉴定出了27个纯菌株,其中放线菌4株、细菌14株、真菌9株,内生细菌的多样性指数最为丰富,与根瘤形成有关的内生放线菌多样性指数最低,但放线菌类群中Frankia sp.(代号H01)菌株优势度指数和均匀度指数最高;从沙枣根际土壤中共分离和鉴定出5属8株AM真菌,Glomus属有3株,Funneliformis属有2株,Septoglomus属有1株,Rhizophagus属有1株,Acaulospora属有1株。Rhizophagus intraradices在样品中的分离频度达到了100%,孢子密度高达48.5个/50 g土,是典型的优势菌株。在沙枣苗木菌根化及根瘤化培育过程中,Frankia sp.(H01)和Rhizophagus intraradices可作为重要的候选菌株。     

生姜中抗黑曲霉活性内生细菌的筛选与鉴定

为了找到一株具有安全、高防霉性特点的内生菌,以解决高水分粮食储藏时使用化学防霉剂的安全、成本问题。试验使用70%乙醇、10%次氯酸钠、5%石碳酸对生姜进行表面灭菌,使用研磨液梯度稀释结合平板划线法从生姜中分离到13株内生细菌。通过菌体对峙试验得到1株对黑曲霉具有明显抑制作用的内生细菌JT716。结合形态学特征、生理生化试验以及16S rDNA同源性分析鉴定该菌为荧光假单胞菌。     

艾纳香内生真菌抗细菌和炭疽菌的活性研究

为获得丰富的艾纳香内生真菌资源,筛选出抗性生防菌株,用于活性次生代谢产物的发现,通过水琼脂法对海南产艾纳香进行内生真菌分离,通过ITS序列分析,对其进行鉴定和分析。采用滤纸片法评价内生真菌发酵产物对细菌的抑制活性,采用平板对峙培养法评价艾纳香内生真菌对植物炭疽菌的拮抗作用。本研究共分离鉴定出191株内生真菌,分属于27属,45种,其中优势菌属为Diaporthe、Paraphoma、Ectophoma、Penicillium、Talaromyces、Hypoxylon、Phomopsis、Colletotrichum和Fusarium。抗细菌活性结果显示,Clonostachys、Fusarium和Diapothe属活性较强。抗炭疽病菌试验显示,Talaromyces、Ectophoma和Penicillium属活性较强。本研究初步探讨了海南产艾纳香内生真菌种类的多样性,并首次对其进行了抗病原菌活性筛查,获得的活性菌株可作为微生物源菌剂开发的重要材料。     

罗汉松和珙桐内生真菌的分离及其多样性研究

为了深刻认识罗汉松和珙桐内生真菌的多样性,分离了183株罗汉松和珙桐内生真菌,结合形态学和分子分类方法对分离内生真菌进行种属鉴定;采用限制性片段长度多态性(RFLP)方法研究分离菌株的遗传多样性。结果表明96株罗汉松内生真菌鉴定为曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、拟茎点霉属Phomopsis、丝枝霉属Aphanocladium、脉孢菌属Neurospora和无孢菌群,Shannon多样性指数为1.73;87株珙桐内生真菌分属于曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、拟茎点霉属Phomopsis、青霉属Penicillium、炭角菌属Xylaria sp.和无孢菌群,Shannon多样性指数为1.53。采用RFLP方法,对全部内生真菌rRNA基因间隔区(ITS)的核苷酸多样性进行了分析,罗汉松和珙桐内生真菌分别聚为22个分枝,同属的菌株聚在一起,同属菌株的RFLP分类相似性在93%以上。罗汉松和珙桐内生真菌中都有无孢菌群,部分菌株与鉴定菌株同处一个分枝中,其他相距较远的无孢菌可能为新的种属。本研究结果提示,罗汉松和珙桐内生真菌的多样性丰富。     

茶饼病病叶表面微生物多样性及病害真菌的分离鉴定

为了分析茶饼病病叶表面微生物多样性，分离鉴定病叶上真菌微生物。以茶饼病病叶与健康叶片为试材，采用扫描电镜对叶表面进行观察，利用16S和ITS测序分析不同叶片的细菌与真菌群落组成。在茶饼病病害叶片表面检测到113种细菌，252种真菌；健康叶片上检测到237种细菌，161种真菌。病叶细菌的多样性显著低于健康叶片，病叶真菌的多样性高于健康叶片。与健康叶片相比，枝孢属和拟盘多毛孢属真菌在病叶中丰度较低，被孢霉属丰度较高。采用PDA培养基从感病叶片表面分离鉴定获得了枝状枝孢菌，该菌可能在茶饼病的感染过程中发挥着重要作用。茶饼病感染后茶叶表面微生物群落结构发生显著变化，分离鉴定出的枝状枝孢菌可能与茶饼病的致病过程密切相关。     

工业大麻内生真菌菌群结构及其在植株内的空间分布特征

[目的]研究旨在探讨不同样地和不同部位大麻组织中内生真菌的多样性及其分布特征,[方法][结果]从4个不同样地大麻（云麻1号）的植株不同部位组织中共分离得到内生真菌531株,其中茎分离出138株,叶分离出393株。经形态学观察和ITS序列分子鉴定发现其分属于29个属,其中茎22个属,叶24个属。有18个属普遍存在于大麻茎和叶中,其中炭疽菌属是大麻的优势菌属,优势度为40.11%。大麻茎部的内生真菌分离率显著低于叶部,接近地面部分的大麻茎叶组织内生真菌分离率最高。4个样地大麻内生真菌多样性指数在1.84到2.46之间,不同样地中大麻内生真菌组成的相似系数普遍较高,同一样地中大麻茎与叶的相似性系数较小。[结论]结果表明,工业大麻（云麻1号）内生真菌多样性偏低、宿主专一性较小。     

栽培三七内生真菌优势种群分离鉴定

栽培三七为五加科人参属多年生草本药用植物,旨在从药用植物栽培三七中分离出能够产生与宿主植株相同或者相似的生物活性物质的内生真菌菌株。以栽培三七为材料,开展栽培三七内生真菌的分离、纯化,依据传统形态特征并结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定。初步从栽培三七中共分离得到内生真菌24株,鉴定为12属（种）,栽培三七不同器官组织的内生真菌种类和数量差异较大,根和叶中最多,茎中较少。其中从叶片中分离出11株,6属;茎中分离出1株,1属;根中12株,5属。统计结果表明叶片中分离出的菌株优势种为普通青霉菌(Penicillium commune)、胶孢刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides),均占叶片菌株分离的27.28%;须根中分离出的菌株优势种为球毛壳菌(Chaetomidium arxii),占须根菌株分离的72.73%。栽培三七内生真菌具有丰富的生物多样性,实验结果为进一步探讨栽培三七内生真菌与生理活性物质之间的关系提供材料基础和实验参数。     

葡萄叶可培养内生真菌多样性与分布特征

为研究葡萄叶可培养内生真菌菌群的多样性,分别对采集于云南省丘北县的云南太阳魂葡萄酒庄资源圃内的9个葡萄品种不同类型叶片进行内生真菌的分离,对分离的内生真菌采用ITS序列分析并结合形态学方法进行分类鉴定。共分离到可培养内生真菌1067株。经鉴定归属为90种28个属。其中Colletotrichum和Alternaria为优势属,优势度分别为39.08%和25.21%。不同品种葡萄可培养内生真菌分离率为0.56~1.13,多样性指数为1.32~2.39,而健康植株成熟叶的内生真菌分离率和多样性指数基本上都高于其幼嫩叶片和发病植株的成熟叶片的。对不同品种葡萄的内生真菌的分离率、多样性指数和相似性分析结果表明,葡萄叶片内生真菌菌群丰富具有一定的宿主专一性,但多样性总体偏低。     

雷公藤内生真菌的抑菌活性研究

通过对雷公藤植物内生真菌进行分离,对内生真菌抑菌活性进行了研究。研究结果显示,从雷公藤不同器官中共分离出22株不同形态型的内生真菌,其广泛存在于植株的根、茎、叶中,其中植株枝中的分离数量高于根和叶。大多数内生真菌都具有抑菌活性,与菌丝体相比,内生真菌的发酵液提取物具有较强的抑菌活性。不同类型病源菌的比较结果表明,筛选的内生真菌对病源性真菌具有较好的抑制作用。     

沙棘内生菌的分离与初步鉴定

植物内生菌广泛存在于各种植物中,在与宿主的协同进化过程中形成了两者的互惠共生关系。通过对采集的野生沙棘健康的根、茎、叶进行组织分离共计获得内生真菌327株,分别归属于链格孢属、青霉属、根霉属、芽枝霉属、毛壳菌属、曲霉菌属、盘多毛孢属、向基孢属、枝顶孢属、头孢霉属等10个真菌属,内生菌表现出丰富生物多样性。从组织分离以及对内生真菌初步鉴定的结果看一些物种还具有组织专化性。     

番茄内生细菌种群动态分析及拮抗菌株的筛选

摘要：采用研磨组织稀释分离法对3个种植地区的番茄内生细菌的种群分布、数量变化规律进行了初步探讨。共分离、纯化得到内生细菌374株,经形态及理化特征鉴定,分属10个不同的属,13个种。其中假单孢菌属Pseudomonas sp.,黄单孢菌属Xanthomonas sp.;肠杆菌属Entenobacter sp.和芽孢杆菌属Bacillus sp.为优势种群。内生细菌在番茄植株种群数量从0.21x104 到13.82x104 cfu.g -1鲜重之间,但不同品种、组织、生育期及种植地,内生细菌的种群和数量各不相同,各组织中内生细菌的种群及数量根中最多,其次是茎和叶,成株期内生细菌无论种类和数量都明显高于苗期。采用平板对峙法从分离的内生细菌中筛选出对番茄灰霉病菌具有体外拮抗活性的菌株32个,占菌株总数的8.56%; 25个菌株对叶霉病菌有抑制作用,占菌株总数的6.68%;对灰霉病菌和叶霉病菌都具有拮抗作用的菌株20个,占菌株总数的5.35%。对灰霉病菌有强拮抗作用的菌株12个,对叶霉病菌有强拮抗作用的菌株仅1个,其中芽孢杆菌是主要的类群。     

灯盏花内生细菌分离及其鉴定

为了解决灯盏花资源紧缺问题,对灯盏花植株及其根际土壤内生细菌进行分离鉴定。利用纯培养方法分离植物内生细菌,根据菌株形态及16S rRNA基因序列系统发育分析对分离到的内生细菌进行鉴定。结果表明获得内生细菌共100株,植株中分离得到62株、土壤中分离得到38株,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和假单孢属(Pseudomonas)为灯盏花和根际土壤内生细菌的优势属,分别占总数的55%、28%。表明灯盏花不同部位和根际土壤内生细菌的数量、分布和种群存有差异性,叶部和正常根际土壤中分离到的内生细菌种类最多。