RNA干扰技术及其应用

RNA干扰(RNA interference, RNAi) 即通过双链RNA的介导特异性降解相应序列的mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默的现象。作为一种简单有效的影响基因表达的工具，RNA干扰已经被广泛应用于许多领域，同时也为基因功能的研究开辟了一条新途径。文章综述了RNA干扰的机制及其应用方面的最新进展。     

RNA干扰技术在育种方面的应用

RNA干扰(RNAi,RNA inference)即双链微小RNA片段能使其同源的m RNA发生特异性降解,从而实现基因转录后沉默的手段~([1]),这种模式广泛存在于动物、植物和真菌中。这种新兴的RNA干扰技术是分子水平的转基因育种重要手段之一,具有育种年限短、定向改良品种等多项优势。本文概述了RNAi的研究历史,对RNA介导的转基因沉默的机制、特点和实施方法等进行了概括,并对其在农业方面的应用进行了阐述。     

五种中药有效成分诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的研究

为了探讨抗病毒中药有效成分能否诱导肠黏膜微血管内皮细胞(IMMVECs)表达IFN-γ,本实验采用双夹心ELISA方法检测了穿心莲内酯、人参皂苷Rb1、苦参碱、绿原酸和甘草次酸等5种中药有效成分对体外培养的大鼠IMMVECs表达IFN-γ的影响。结果表明：一定浓度的穿心莲内酯、人参皂苷Rb1、苦参碱、绿原酸和甘草次酸均可以诱导大鼠IMMVECs表达IFN-γ,与空白对照组相比都具有极显著意义(P<0.01)。在同一个时间段内, 5.0 mg/L穿心莲内酯组IFN-γ的表达量高于10.0 mg/L穿心莲内酯组,20.0 mg/L人参皂苷Rb1组IFN-γ的表达量高于40.0 mg/L人参皂苷Rb1组,20.0 mg/L苦参碱组IFN-γ表达量高于40.0 mg/L 苦参碱组,5.0 mg/L 绿原酸组IFN-γ的表达量高于10.0 mg/L绿原酸组,5.0 mg/L甘草次酸组IFN-γ的表达量均高于10.0 mg/L甘草次酸。本结果提示：穿心莲内酯、人参皂苷Rb1、苦参碱、绿原酸和甘草次酸均可以激活MVECs诱生IFN-γ,而IFN-γ的表达可能与中药的抗病毒作用有直接或间接的关系。     

RNA干扰研究现状

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。简要概括RNAi作用机制和siRNA技术的原理,同时也讨论了RNAi技术在其他领域,如在基因信号通路研究、高通量研究基因功能、基因治疗如肿瘤研究和疾病治疗等方面的应用。     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

RNA干扰及其植物抗病毒应用

【研究目的】RNA干扰(RNA interference,RNAi)是分子生物学研究领域的一项新兴技术,在动植物的遗传改良、功能基因组、基因治疗等研究中广泛应用;【方法】它是指一些小的双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象;【结果】本文就RNA干扰的作用机制、RNA干扰与植物病毒间的互作以及RNA干扰表达载体构建的一些研究进展进行了综述;【结论】随着RNAi研究的进一步深入,RNAi必将成为遗传育种工作者培育抗病毒植物的有力手段,促进植物抗病育种的发展。     

种植密度对小麦产量和群体质量影响的研究进展

合理密植是小麦生产中构建合理群体结构、夺取高产的重要栽培措施。分析了种植密度对小麦产量及其构成和群体质量的影响。分析表明：种植密度对小麦产量和群体质量有显著性的影响。种植密度的调整可以有效协调小麦单位面积穗数与穗粒数、千粒重的关系,进而获取高产;还可以有效控制小麦群体结构的变化,使之更加合理。     

对位红抗原合成和多克隆抗体的制备

制备了一种特异性强的抗对位红的多克隆抗体。采用混合酸酐法将活化的对位红半抗原与阳离子化牛血清白蛋白（cBSA）偶联成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体,利用紫外分光光度计分析结合物的结合情况,间接ELISA和间接竞争ELISA分析抗体特性。紫外扫描分析的免疫原对位红与蛋白结合的偶联率为14:1,间接竞争ELISA法分析多克隆抗体效价达到1×106,50%抑制率检测限为7.43 ng/mL,检测的对位红线性范围在0.1 ng/mL～1μg/mL,抗体与对位红和苏丹红I交叉反应率分别为100%和97.8%,与苏丹红II、III、IV和甲苯胺红的交叉反应率很低,与罗丹明类色素无交叉反应。制备的对位红多克隆抗体具有很高的特异性,与其他色素交叉反应率低,可用于对位红在食品中残留的检测。     

土传病害生防菌的分离筛选及鉴定

为了使蛋鸡粪有机肥兼有防治作物土传病害的多功能性。实验从安徽省农科院实验田及蛋鸡养殖场等环境中共分离出170 株真菌,首先将分离菌与辣椒炭疽病(Colletotrichum capsici)进行平板对峙实验,再通过复筛选出7 株菌,同时对该7 株菌进行抑菌谱、耐温实验和蛋鸡粪肥中增殖实验,效果较好的菌株最终进行分子生物学鉴定。结果表明：筛选出的菌株中编号为TCC53 对油菜菌核病和麦纹枯的抑菌率分别可达90.4%、82.3%,TCC157 对辣椒炭疽病和辣椒疫霉的抑菌率分别可达88.6%、71.2%,同时该两株菌均可在40℃以上生长。通过分子生物学鉴定得出TCC53 和TCC157 分别为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)和皮落青霉(Penicillium crustosum)。皮落青霉和棘孢曲霉均为环境中常见真菌,生长快、不具有致病性,将其添加至蛋鸡粪有机肥中有望提高作物的抗病效果又可改善土壤结构的微生物肥料。     

青虾transformer-2基因RNA干扰规律的研究

通过对青虾性别调控相关基因transformer-2（tra-2）的RNA干扰规律进行研究,探讨了tra-2 基因RNA干扰的最适注射部位、注射剂量、干扰效果以及干扰规律等。通过对青虾肌肉、心脏、围心腔和眼柄基部注射比较发现,围心腔注射死亡率最低,适宜RNA干扰研究。采用4 μg/g 的dsRNA剂量进行时间依赖性干扰试验,RT-PCR检验注射后第1,7,14 天的卵巢tra-2 表达量,结果显示第7 天基因表达量出现显著降低（P<0.05）。不同剂量水平（0.4 μg/g、4 μg/g 以及12 μg/g）干扰研究发现,0.4 μg/g dsRNA没有干扰结果,4 μg/g 和12 μg/g 剂量的干扰效果均显著。与4 μg/g 的剂量相比,12 μg/g 的dsRNA能在较短时间内起到明显的干扰效果,且能持续较长的时间,表明干扰规律会随着剂量的改变而变化。但两组tra-2的最低表达量分别为正常水平的23%和21%,无显著差异（P>0.05）。     

siRNA干涉技术在黄曲霉毒素抑制中的研究

构建真菌基因敲除突变体的传统方法周期较长,为了快速检测和高通量筛选具有特定功能的目标基因,本研究利用小分子RNA干涉技术,沉默了黄曲霉毒素生物合成关键基因,有效降低了黄曲霉毒素B1(AFB1)的生物合成。通过设计合成人工小干涉RNA(artificial siRNA),特异靶向黄曲霉毒素合成路径的关键基因aflR,将siRNA直接转化黄曲霉原生质体,有效沉默了黄曲霉毒素合成的关键调控基因aflR,并导致AFB1的合成明显减少。利用特异靶向黄曲霉毒素合成路径中其他11个靶标基因的siRNAs,通过原生质体转化方法可直接沉默这些基因,沉默后这些基因的转录水平均显著降低,其中hypC和aflW两个基因沉默后AFB1的生物合成量与对照相比下降显著。此外,利用特异靶向黄曲霉毒素合成基因簇外基因的siRNA,如pks-nrps基因,通过siRNA干涉技术沉默该基因同样可显著降低AFB1的合成。因此,本研究借助小分子RNA干涉技术,建立了一种快速检测和高通量筛选黄曲霉毒素生物合成路径相关基因的反向遗传学方法。     

RNA干涉机制的研究进展及植物学意义

RNA干涉(RNAi)是指由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,其中small RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中起关键作用。本文综述了RNAi中siRNA和microRNA分别介导的作用机制,RNAi在植物中的研究现状,主要包括转基因植物中的RNA干涉和植物病毒诱导的RNA干涉等方面的研究概况。评述了RNAi在植物学研究中的意义,主要包括功能基因的研究、转基因植物的研究及植物抗病性研究。     

棉铃虫HaHR3基因的克隆及其植物RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因,该基因含有1671 bp的完整开放阅读框。序列分析表明,HaHR3与多种昆虫蜕皮调节转录因子高度同源。利用生物信息学方法对HaHR3的结构特征进行分析发现,HaHR3具有蜕皮调节转录因子超家族的典型特征,包括两个锌指结构和一个DNA结合结构域,不存在信号肽序列和N糖基化位点。选择HaHR3基因的部分片段构建了RNAi中间载体pRNAi1017-HaHR3sa,再将HaHR3正反向序列亚克隆至植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS,成功构建了由35s启动子调控的HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3。这一载体的成功构建为下一步通过植物介导的RNA干扰技术防治棉铃虫打下了坚实的基础。     

RNA干扰对烟草NtPPO8基因沉默的效应分析

多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。     

以RNA干扰γ-氨基丁酸转氨酶1基因(OsGABA-T1)表达提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量

γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸, 具有降血压等功能。为提高稻米中GABA含量, 利用RNA干扰技术, 构建水稻中GABA代谢关键酶GABA转氨酶1基因(OsGABA-T1)的干扰载体, 通过农杆菌介导法, 将其转化至粳稻品种宁粳1号中。实时荧光定量PCR检测结果表明导入的RNA干扰结构成功地降低了目的基因OsGABA-T1的表达, 且干扰家系中OsGABA-T2基因表达也随之下降。对转基因T₃代稻米GABA含量测定发现, 糙米中GABA含量相对于对照增加了13倍以上, 精米中GABA含量也显著增加, 而其他主要氨基酸含量则没有明显变化。测定储藏4个月的转基因稻米发现, GABA含量仍具有较高水平。所以, 利用RNA干扰技术可有效提高稻米γ-氨基丁酸(GABA)含量, 为培育富含GABA的降血压功能性水稻品种提供基础。     

津田芜菁隐花色素CRY1 RNA干涉载体的构建

隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异的片段。同时根据Gateway克隆技术特点,设计含有attB接头的引物。利用高保真的LA Taq DNA聚合酶,通过PCR方法在目的片段的两端加上attB序列。通过BP反应和LR反应将CRY1基因片段克隆到pH7GWIWG2(I)双元干涉载体。对重组载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的鉴定结果表明成功构建了CRY1基因的干涉载体。利用Gateway克隆技术构建植物干涉表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究其功能奠定了基础。     

RNA干涉技术与棉花高油育种

 棉子脂肪酸既是重要的食用油,又是重要的工业原料。但是关于棉子遗传改良的研究报道甚少。研究表明,PEPcase和ACCase的相对活性决定种子的蛋白质与油脂的含量,应用RNAi技术抑制PEPcase催化活性,可以提高脂肪酸总量。本文概述了棉花油分与RNAi技术的研究现状,并阐述了应用RNAi技术改良棉花高油分育种的技术路线。     

Mechlppdk基因在木薯中的表达分析及RNA干扰载体构建和遗传转化

本研究为了明确丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)在木薯中的表达谱,创制Mechlppdk的干扰株系,以期为Mechlppdk的功能研究提供材料.本研究以栽培型木薯Arg7为材料,用qPCR的方法分析Mechlppdk在木薯根、茎、叶中的表达谱;采用RNA干扰的方法,构建Mechlppdk的干扰载体,并遗传转化木薯脆性愈伤,经...