菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

10种药用植物萜类合酶(DXS)生物信息学分析

为研究药用植物DXS酶的性质及其结构功能,利用生物信息学方法对GenBank中青蒿、砂仁、铁皮石斛等10种药用植物DXS编码氨基酸序列的理化特性、系统发育进化、亲/疏水性、亚细胞定位、磷酸化位点、二级结构、信号肽、跨膜结构、功能域等进行分析和预测。结果表明：不同植物DXS酶氨基酸序列的理化性质基本一致;在进化关系上可划分为2类;DXS酶蛋白主要表现为亲水性蛋白;大多数定位于叶绿体,少数定位于线粒体;丝氨酸磷酸化位点占据主导地位;α-螺旋是DXS多肽链中大量的结构元件,散布于整个肽链中;除了铁皮石斛具有1个信号肽,其余DXS氨基酸序列不具有信号肽,可推测出DXS可能不是分泌性蛋白;没有跨膜结构域;具有3个功能域分别为TPP_superfamily、Transket_pyr_ superfamily和Transketolase_C superfamily。研究结果将为DXS的酶学特性及萜类生物合成的分子机理研究提供理论参考。     

万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段的克隆及分析

为了研究万寿菊中玉米黄质生物合成途径的关键酶基因,首先根据不同物种的ZEP基因进行序列比对找到保守区域设计简并引物,然后利用RT-PCR方法,以万寿菊花瓣总RNA为模板克隆万寿菊ZEP基因cDNA的片段,并进行序列分析。结果表明,万寿菊ZEP基因片段长度为1 058 bp,编码352个氨基酸残基,其序列与其他植物ZEP基因同源性最大为92%;其翻译产物属于亲水性蛋白;且结构域预测结果发现TeZEP基因编码的氨基酸序列含有一个NADB_Rossmann超家族和玉米黄质环氧化酶的特征性结构黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。本研究成功克隆了万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段并对其进行了序列分析,这为进一步研究该基因功能提供了依据,也为构建转基因植物和沉默基因植株以提高玉米黄质合成量提供了一定的参考。     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。     

小叶杨胆碱单氧化物酶(CMO)基因的克隆与转化杂种落叶松及表达

甜菜碱是在生物界广泛存在的一类细胞相容性物质,它不仅能使细胞在干旱等胁迫条件下与环境保持渗透平衡,而且还具有稳定复杂蛋白质高级结构的能力。胆碱单氧化酶(CMO)在植物体中是催化胆碱转变为甜菜碱的关键酶,单独转化CMO基因的转基因植物可以完成甜菜碱的合成,起到抗盐、耐旱的作用。小叶杨是我国特有乡土树种,具有抗旱、耐瘠薄、适应性广、生长优良、寿命长等特性,在荒沙及黄土高原区均能生长。本研究以小叶杨为材料构建了干旱胁迫和正常生长条件下的cDNA文库,以特异性引物从中扩增出一条1269bp大小的DNA片段,经序列分析证实该片段编码胆碱单氧化物酶(CMO);将该片段构建入植物表达载体pBI121中,在落叶松杂交育种中利用花粉管通道法将带有该CMO基因的植物表达质粒转入杂种落叶松,收获球果取出种子,提取转化种子发芽长出幼芽的DNA,特异性PCR扩增和Southern、WesternBlotting检测证实落叶松中CMO基因的插入。因此,我们不仅克隆得到了小叶杨编码胆碱单氧化物酶(CMO)的基因,还将其导入杂种落叶松,得到CMO超重表达的转基因杂种落叶松。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

植物AAO基因家族的鉴定与生物信息学分析

抗坏血酸氧化酶(AAO)是一种多功能的酶,在调节植物发育过程和应激反应方面发挥重要作用。本研究以水稻抗坏血酸氧化酶基因OsAAO2为靶序列,在葡萄、小麦、水稻等物种中鉴定出23个AAO成员,分析其染色体定位、预测蛋白理化性质和二级结构、亚细胞定位、保守基序并且构建系统发生树。结果表明,AAOs在理化性质上有很大的差异,如分子量和理论等电点(pI),但在N端都含有信号肽;AAO家族蛋白富含碱性氨基酸,均为亲水性蛋白;蛋白的二级结构主要是无规则卷曲和延伸链;保守基序分析发现,AAOs蛋白较稳定,具有很强的保守性;亚细胞定位分析发现,AAOs分布在叶绿体、液泡、细胞质等不同的细胞器中。这些结果揭示了植物中AAO基因功能的多样性,为研究它们在植物中的生物学功能提供一定参考。     

无核白葡萄多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

为获得无核白葡萄中多酚氧化酶(PPO)的基因序列,以无核白葡萄果实为试材,进行基因同源克隆,得到多酚氧化酶基因CDS全长序列,其完整的编码框为1 824 bp,编码607个氨基酸(GenBank登陆号为KP271928);系统进化分析可知,其与葡萄科植物PPO基因同源性最高;生物信息学方法发现该蛋白分子量为67 392.44 Da,等电点为6.42,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有一个跨膜结构域,为亲水性蛋白;二级结构预测发现,PPO具有CuA与CuB两个结合区,分别嵌入蛋白活性腔中。该研究为进一步从分子水平探讨多酚氧化酶与褐变的关系奠定理论基础。     

瑞香狼毒超临界CO2萃取物的杀螨毒力及机理初探

为了测定瑞香狼毒超临界CO2萃取物对朱砂叶螨的触杀毒力,并了解其作用机理,笔者采用玻片浸渍法测定瑞香狼毒超临界CO2萃取物（SCE）对朱砂叶螨的触杀毒力,观察其对朱砂叶螨的致毒症状;结果表明：SCE对朱砂叶螨24 h的触杀LC50值为2.411 mg/mL;中毒试螨表现出类似神经毒剂的致毒症状,如兴奋、痉挛等。随后测定了SCE对朱砂叶螨神经系统靶标酶（乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶）活性的影响。结果表明,SCE能够显著抑制试螨乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性;据此推测,SCE对朱砂叶螨可能具有神经毒性。     

基于转录组金银花WRKY转录因子的挖掘与分析

WRKY转录因子是植物抗逆应答过程中最为常见的蛋白家族。为了挖掘金银花抗寒相关的WRKY基因,本研究基于已有的转录组数据,利用植物转录因子数据库和BioEdit对WRKY进行筛选及保守结构域分析,对筛选出的WRKY转录因子利用ExPASy进行理化性质分析,利用PSORT进行亚细胞定位预测,NetPhos进行磷酸化位点分析并且利用MEME数据库对WRKY基因的氨基酸进行序列分析,运用MEGA软件对筛选的金银花WRKY转录因子基因和21个已知抗寒的WRKY基因进行序列同源比对,并构建系统进化树。结果表明:金银花中筛选的30个WRKY基因的蛋白为85～721个氨基酸,理论等电点的范围为4.85到9.76。所有LjWRKY基因编码的蛋白中只有LjWRKY6为稳定蛋白,其余均属于不稳定蛋白,所有蛋白均属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果,LjWRKY所有蛋白定位于细胞核。除LjWRKY23不具有Try磷酸化位点,其它所有氨基酸均具有Ser、Thr和Try磷酸化位点。LjWRKY蛋白比较保守,WRKYGQK没有发生任何变异,且包含三类WRKY转录因子。系统进化树发现,有12个WRKY基因与已知抗寒基因有同源性,推测其参与了金银花低温逆境下的反应。研究结果可以通过筛选的WRKY基因,进行进一步的转基因验证,进而为植物抗寒分子育种提供分子基础。     

水稻胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

高等植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成,其中由胆碱单加氧酶(CMO)催化第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应.采用生物信息学技术和RT-PCR的方法从水稻幼苗组织中分离得到了水稻CMO基因的cDNA克隆,将其命名为OsCMO.该基因含有10个外显子和9个内含子,其开放阅读框编码一条长为410个氨基酸残基的多肽,与拟南芥、山菠菜、苋、碱蓬和甜菜等植物的胆碱单加氧酶的氨基酸序列的一致性50%～62%.mRNA分析表明OsCMO基因在水稻幼苗组织中的表达受高盐、低温和干旱等胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在抵御非生物胁迫中发挥重要作用.     

农杆菌介导的辽宁碱蓬胆碱单氧化酶基因CMO转化烟草提高抗氧化胁迫的研究

通过农杆菌介导的遗传转化,将来自辽宁碱蓬的甜菜碱合成关键基因－胆碱单氧化酶基因CMO 转入烟草,以提高烟草耐受氧化胁迫的能力,并对得到抗生素抗性植株进行了分子检测和百草枯诱导 的氧化胁迫。Southern 和Northern 检测表明CMO 已经整合到烟草基因组中,并得到了正确的表达,但 不同转基因株系中的拷贝数不同,株系T1、T2、T6 为单拷贝;株系T4、T5 为双拷贝;株系T3 为3 个拷 贝。在10 μM 和20 μM百草枯胁迫24 h 的情况下,转基因植株表现了较强的耐受氧化胁迫能力,各转 基因株系和野生型相比具有较低的丙二醛含量和较高的超氧化物歧化酶活性。这可能是转基因植物 中甜菜碱的积累诱导或保护了抗氧化酶的活性,使得转基因植株受到的氧化胁迫较低,转基因植株中 较低的电导率也证明了这一点。转CMO 基因烟草耐氧化胁迫能力的提高,说明CMO 基因可以进一步 在玉米、水稻等重要农作物中应用以提高其耐受干旱、低温等非生物胁迫的能力。     

苹果SnRK2基因家族的鉴定和生物信息学分析

SnRK2（蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2）是植物特有的一类Ser/Thr 类蛋白激酶,参与植物体内多种信号途径的转导,在植物逆境生理过程中扮演了重要的角色。本文利用隐马可夫模型搜索和系统建树的方法,在苹果基因组中鉴定出了16个SnRK2基因家族成员,然后从系统发生、理化性质、二级结构、motif、C末端序列和EST等方面对其进行了预测和分析,并分析了苹果与拟南芥、水稻、玉米等的SnRK2基因家族之间的关系。结果表明,苹果中鉴定的基因与拟南芥、水稻、玉米所有的SnRK2蛋白一起分成了3个亚族。系统发生、motif和C末端序列分析表明,苹果SnRK2蛋白激酶家族具有较高的保守性。本研究为苹果SnRK2基因家族生物学功能的研究奠定了生物信息基础。     

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。     

DOF转录因子AtDof1.7 RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。     

辣椒TALE转录因子的生物信息学分析

TALE转录因子家族广泛存在于植物中,在植物生长发育的各个阶段发挥重要作用,但是目前关于辣椒TALE转录因子家族的研究鲜见报道。本研究借助于生物信息学手段,通过HMMER、SMART、MEGA5.05、GSDS、MEME、DNAMAN、SOPMA、SWISS-MODEL等软件和网站对辣椒TALE转录因子类型、结构域、系谱进化、蛋白理化性质及高级结构、信号肽进行分析。分析显示20个辣椒TALE转录因子家族成员均含有HOX主结构域;系统进化树分析显示,20个TALE转录因子家族成员可分为KNOX和BEL两个亚族,同一亚族含有相同的保守基序以及相似的基因结构和蛋白跨膜结构;辣椒TALE转录因子家族的内含子在3~6之间;α-螺旋和无规则卷曲是该家族基因主要的二级结构,三级结构中都含有螺旋-转角-螺旋结构。本研究分析了辣椒TALE转录因子的生物信息学的特征,结果表明该基因家族在辣椒中具有稳定、保守的特点,这为今后研究该基因参与的生长发育过程及其作用奠定了一定的理论基础。     

棉花纤维特异转录因子GhMADS9的克隆及功能初步分析

从快速伸长的纤维细胞中克隆到了一个转录因子,通过序列比对发现其具有典型的MADS-box结构域,命名为GhMADS9。进化树分析表明GhMADS9属于典型的MIKC类MADS转录因子,与在拟南芥胚中高表达的转录因子AGL15亲缘关系最近。RT-PCR和原位杂交试验表明GhMADS9在纤维细胞中特异表达。酵母单杂交试验证明GhMADS9具有转录因子激活活性。继续研究GhMADS9对下游基因的调节机制有利于更加深入地了解棉纤维发育机制。     

AP2基因家族的起源和棉花AP2转录因子在抗病中的作用

植物中庞大的AP2基因家族成员因其广泛参与植物响应外界环境胁迫、生长发育相关的转录调控而备受重视。AP2基因曾被认为植物所特有,但最近在蓝藻、线虫和病毒中发现了具有AP2结构域和位点特异核酸内切酶的蛋白。所以有人认为当今植物中的AP2基因起源于细菌或者病毒的基因的横向转移,AP2结构域可能来自后来进化为叶绿体的原始蓝细菌的内共生。ERF是AP2大家族中的一个亚族,它编码的蛋白能特异结合含有GCC盒的病程相关基因的表达,参与植物抗病反应。ERF基因的表达受到疾病相关刺激以及环境胁迫的诱导,并且在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用。同时,某些ERF基因在转基因植物中的超表达表现了一定的广谱抗性,因而在分子育种中具有一定的应用前景。棉花上AP2基因家族的基因克隆与分析最近才得以进行,介绍了我们在棉花上相关的研究工作并讨论了它们在植物抗病反应中的作用。     

马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

植物光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors,PIFs)属于碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族,通过将光和温度等外部环境信号与植物体内源信号途径相整合,进而形成复杂的信号转导网络来精密调控植物的生长发育进程。目前,关于马铃薯PIF家族基因的研究较少,鉴定和分析StPIF家族成员有助于进一步提高马铃薯的产量和品质。本研究运用生物信息学方法,以拟南芥PIF家族成员蛋白序列作为源序列,通过在马铃薯基因组数据库中进行BlastP分析鉴定出7个StPIFs家族成员,并对其进行系统进化、染色体分布、复制事件、蛋白理化性质、基因结构、Motif预测、启动子顺式作用元件、基因表达模式以及对高温胁迫的响应分析。结果显示,StPIF家族所有成员均含有Motif 1 (bHLH结构域)、Motif 2 (APB结构域)基序;在StPIF基因的启动子区域预测到多个参与光响应、激素、干旱、低温、昼夜节律以及防御和应激反应调控元件;基因表达模式和现蕾期高温胁迫响应分析表明,家族成员具有明显的组织表达特异性,基因存在功能...