猕猴桃溃疡病拮抗菌株筛选及田间药效试验

【目的】分离筛选拮抗猕猴桃溃疡病内生放线菌,为猕猴桃溃疡病生物防治提供依据。【方法】分离筛选猕猴桃内生放线菌,在使用管碟法进行抗生素效价测量的同时,对其中发酵液的部分内容进行测定,重点进行抑菌活性测定,以此筛选高抗性菌株。采用喷雾法和涂抹法两种方法进行田间防效试验。【结果】从采集的猕猴桃植株的枝条和叶片等组织中,分离得到37株内生放线菌,对其进行培养、分离和纯化,然后在此基础上进行拮抗实验、WN34菌株发酵液活性粗提物制备和大田试验。田间试验结果表明:采用喷雾法,WN34菌株发酵液粗提活性物在喷药28 d后,防效达到66.0%。采用涂抹法,WN34菌株发酵液粗提活性物对猕猴桃溃疡病的防治效果为78.2%。【结论】WN34菌株发酵液作为一种新型的抗猕猴桃溃疡病生物防治药剂有很好的开发潜力。     

核桃内生放线菌的分离、鉴定及抗菌活性

分别从生长于云南楚雄的核桃根、茎、叶中分离内生放线菌,并对分离菌株进行纯化、保存。通过对分离菌株生长特性、形态观察、分子分类等研究,对菌株进行初步鉴定与抗菌活性研究。结果表明,共分离得到42株内生放线菌,其中从根中分离11株、从茎中分离12株、从叶中分离19株,分离菌株均属于链霉菌属。试验内生放线菌菌株SA8对拟盘多毛孢、链格孢、德氏孺孢、灰葡萄孢、疫霉这5种病原菌均有抑菌作用。     

新疆13种荒漠植物根内生放线菌多样性及其抗菌活性筛选

以荒漠植物骆驼刺、铃铛刺、碱蓬、盐穗木、柽柳等13种植物的根为材料,利用SCA培养基分离其内生放线菌,通过菌株16S rRNA基因测序,分析荒漠植物内生放线菌物种多样性。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、细极链格孢菌、大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌为靶标,通过琼脂扩散法和平板对峙法开展抗菌活性筛选。从13种荒漠植物分离出533株内生放线菌,鉴定的361株,分布于6个目,7个科,9个属,77个种,另有3个潜在新种,其中链霉菌属为优势类群,冢村氏菌属与伦茨菌属首次从植物中分离得到。研究表明13种荒漠植物内生放线菌多样性有明显差异,骆驼刺内生放线菌最丰富,分离到6个属27个种,链霉菌属有20个种;老鹳草分离到的菌株数量最多,有3个属;铃铛刺分离到2个属,其中的链霉菌属有28个种;猪毛菜、盐穗木等植物只分离到链霉菌属。抗菌活性筛选显示80株放线菌有抗菌活性,其中链霉菌74株,拟无枝酸菌3株,拟诺卡氏菌、糖霉菌和链孢囊菌各1株。本研究为寻找新型抗菌活性化合物,为生物医药和生物肥料提供菌株来源。     

宁夏干旱荒漠区苦豆子内生放线菌的分离鉴定

采用3种消毒时间对健康苦豆子种子内及植株体内的内生放线菌进行分离.结果表明:消毒3 min来消除非内生菌的影响效果较好;同一植株分离出内生放线菌的数量,种子最多,其次是茎部和根部,叶部较少.合并形态相同的分离物,从苦豆子种子、根、茎和叶分离出的内生放线菌,经初步鉴定分属5个属,86株为链霉菌属,占分离总数的68.8%;19株为诺卡氏菌属,占15.2%;14株为放线菌属,占11.2%,其余分属于小单孢菌属和游动放线菌属.     

臭椿内生放线菌分离与抑菌活性检测

【目的】从臭椿中分离内生放线菌,测试其代谢产物的体外抑菌活性。【方法】采用4种培养基分离臭椿组织中的内生放线菌,采用琼脂移块法和平板对峙法研究臭椿内生放线菌的抑菌活性,通过形态特征和16S rRNA序列分析对高活性菌株进行菌种鉴定。【结果】4种培养基中以HV培养基分离效果最为理想;从臭椿组织中共分离纯化获得45株内生放线菌,有26株菌株对指示菌表现出不同程度的抗菌活性,占总分离菌株的57.78%;其中,菌株AAA19对6种供试菌株均有抑制能力,拮抗作用最强,菌种鉴定结果表明该内生放线菌为抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)。【结论】臭椿内生放线菌具有抗菌作用,菌株AAA19具有潜在的开发应用价值。     

小檗内生放线菌H21的鉴定及抑菌活性成分分析

【目的】从药用植物小檗（Berberis thunbergii）中筛选抗菌活性内生放线菌,对活性菌株的分类地位及抑菌活性进行研究,分离并鉴定候选菌株发酵液中活性成分的化学结构及其抑菌活性,为农用杀菌剂的创制提供依据。【方法】采用选择性培养基从小檗叶片分离内生放线菌,16S rDNA法进行菌株鉴定;采用管碟法测定发酵液对烟草青枯病菌 （Ralstonia solanacearum）等7种供试菌的抗细菌活性,采用抑制菌丝生长速率法测定发酵液对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等7种植物致病菌的抗真菌活性;依次采用大孔树脂吸附、硅胶柱层析及反相高效液相色谱（HPLC）等技术分离纯化活性组分;采用核磁共振波谱（NMR）和质谱（MS）技术对分离到的活性成分进行结构鉴定;采用微量肉汤稀释法测定化合物对烟草青枯病菌等7种细菌的最低抑菌浓度,抑制孢子萌发法和菌丝生长速率法测定化合物对番茄灰霉病菌的抗菌活性。【结果】分离到一株活性菌株H21,该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为链霉菌（Streptomyces sp.）;除铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外,H21菌株发酵液对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）等多种病原细菌有明显的抑菌活性;H21发酵液对番茄灰霉病菌表现出较强的抑制菌丝生长作用,对其他供试病原真菌无明显的抑菌活性;从H21菌株发酵液中分离鉴定了3个化合物,分别为N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺、环-（L-亮氨酸-L-精氨酸）和二硫吡咯类抗生素-全霉素;全霉素为广谱抗生素,其对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.156、0.313、0.078、0.313、0.156和0.313 µg·mL^-1;对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑菌中浓度（IC₅₀）分别为13.56和7.89 µg·mL^-1。【结论】小檗内生菌放线菌H21可能是一种新的全霉素产生菌,其对植物致病细菌烟草青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌有抗菌活性,全霉素对于开发针对致病细菌的农用杀菌剂具有重要的参考价值。     

陕西关中地区猕猴桃溃疡病调查及其生物防治研究

[目的]掌握陕西关中地区猕猴桃溃疡病发病特点,筛选出对猕猴桃溃疡病有防治作用的植物内生放线菌。[方法]对陕西关中地区(杨陵、周至、眉县)13个村65个猕猴桃园中猕猴桃溃疡病发病特点进行调查分析,同时在242株植物内生放线菌中筛选猕猴桃溃疡病菌拮抗菌株并进行田间病害防治试验。[结果]陕西关中地区猕猴桃溃疡病的平均发病率达7.95%;猕猴桃品种与发病率密切相关。对猕猴桃溃疡菌有抑制活性的菌株有76株,其中35株的发酵液对猕猴桃溃疡菌的抑菌圈直径≥20 mm,TIASA5菌株对4种靶标细菌均具有抑制活性,而gCLA4菌株不仅对4种靶标细菌具有抑制活性,还对10种植物病原真菌有较强的抑制活性。田间试验结果表明,gCLA4菌株发酵液对猕猴桃溃疡病具有明显防效,21 d的相对防效可达66.7%。[结论]gclA4菌发酵液的抑菌谱广,gclA4菌具有开发成为一种广谱农用杀菌剂的潜力。     

2株三尖杉内生放线菌的分离鉴定与活性研究

从三尖杉根部分离得到2株内生放线菌ECA023、ECA045,通过培养观察与16SrDNA序列分析,初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)和小单孢菌属(Micromonospora)放线菌.采用滤纸片法和MTT法研究了菌株发酵液的抑菌和抗肿瘤活性,结果表明:2株内生放线菌对4种病原菌和K562肿瘤细胞株均显示出较强的抑制活性,其中ECA023对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表现出较强的拮抗作用,ECA045对K562细胞的平均抑制率达56.83％.     

几种野生药用植物内生放线菌的遗传多样性及抗菌活性

从四川省雅安市采集的7份中药材植物样品中分离出106个内生放线菌菌株,采用16S rDNA-RFLP和16SrDNA序列分析研究了其系统发育。16S rDNA-RFLP将供试菌株分成了6个遗传群;代表菌株的系统发育分析表明,供试菌株主要为链霉菌属(Streptomyces);其余菌株分布于野野村菌属(Nonomuraea),小单孢菌属(Micromono-spora),拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),糖霉菌属(Glycomyces),厄氏菌属(Oerskovia),纤维菌属(Cellulosimicrobi-um)等6个稀有放线菌属,大多数供试菌株对细菌及病原真菌有较为广谱的抗菌活性。揭示了该区域药用植物内蕴藏着丰富的内生放线菌资源。     

淡紫灰链霉菌gCLA4对猕猴桃溃疡病预防效果及抑菌活性成分分离鉴定

为明确分离自黄瓜叶片的内生淡紫灰链霉菌gCLA4菌株（gCLA4）对猕猴桃溃疡病预防效果及其抗菌活性物质,通过室内离体枝条接种及田间喷淋树干的方法评价其预防效果;借助“生物活性追踪”方法,采用离子交换树脂吸附、凝胶柱层析、质谱、核磁共振波谱分析手段对gCLA4的抑菌活性物质进行分离鉴定。室内离体枝条和田间树干喷施结果表明,gCLA4菌株发酵液对猕猴桃溃疡病的防效分别为83.43%和71.07%,明显优于市场对照生防菌剂解淀粉芽孢杆菌Ba168 WP和枯草芽孢杆菌WP。室内分析鉴定显示其主要抑菌成分为链丝菌素F。皿内抑菌结果表明,链丝菌素F与商品中生菌素原药对病菌的抑制效果差异不显著,抑菌圈直径分别为20 mm和22 mm,大于gCLA4发酵滤液的抑菌圈直径16 mm。综上可见：gCLA4对猕猴桃溃疡病防控效果显著,其活性成分链丝菌素F,具有溃疡病绿色防控生物药剂开发应用的巨大价值和潜力。     

杜仲内生真菌中抗苹果炭疽病活性菌株的筛选

对杜仲植株中的内生真菌进行分离纯化,共得到32株内生菌株。通过离体平板对峙培养检测、光学显微镜观察,以及测定在活体果实上的拮抗活性,研究杜仲拮抗真菌与病原菌及其寄主植物苹果果实之间的相互作用。对峙培养显示杜仲内生真菌DZGS07对苹果炭疽菌有较强拮抗作用,具有较强的营养和空间竞争能力,显微观察表明其能造成病原菌菌丝畸形等现象。在生防研究中,内生真菌DZGS07对苹果炭疽病具有较好的生防潜力,处理后的第7天防效达84.19%;对该菌株的ITS 序列进行测定分析,初步鉴定DZGS07为炭疽菌属(Colletotrichum)的真菌。     

苦苣菜内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

为开发陕北野生苦苣菜内生菌资源,发现潜在药用活性成分和新的医药先导化合物。以苦苣菜健康植株的根、茎、叶为材料,采用平板对峙培养法测定其对11株供试指示菌的抑菌活性,以苦苣菜提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析、硅胶柱层析和高效液相色谱分析。从中共筛选出95株内生菌,通过抑菌试验发现其中20株对1种或多种指示菌具有抑菌活性,占分离菌株数的21.05%,其中UG-004、UG-036、UY-085、CY-009、CJ-014、CG-033和CG-035 7株具有较强谱抑菌活性。薄层层析检测结果表明,菌株CG-035的发酵产物在R_f为0.35处有与苦苣菜提取液的层析带迁移率相当的显色带。并通过高效液相色谱分析确定其主要成分为黄酮类物质。菌株CG-035能发酵产生黄酮类或其类似化合物,表明苦苣菜内生菌在次级代谢产物方面具有研究潜力,这为内生菌在微生物药物研究方面提供了理论依据。     

马铃薯连作土壤拮抗放线菌研究

为探索马铃薯连作土壤中拮抗放线菌的资源状况,并从中筛选有应用价值的马铃薯连作土传真菌病害生防放线菌,采用皿内琼脂块和发酵液抑菌试验法筛选对马铃薯黑痣病病原立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、2株马铃薯干腐病病原菌硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）及马铃薯黄萎病病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)有较强拮抗性的放线菌;采用16S rRNA序列分析法对其中3株高活性拮抗放线菌进行鉴定;盆栽试验研究高活性广谱拮抗菌娄彻氏链霉菌 (Streptomyces rochei)孢子粉对盆栽马铃薯植株生长及抗逆性影响。结果表明：(1)在甘肃省定西市不同连作年限马铃薯根区及根外土壤中均存在少量对马铃薯土传病原真菌有较强拮抗作用的放线菌;在大部分病、健株根区及根外土壤中,拮抗菌所占比例呈病株大于健株的趋势。(2)筛选到3株高活性广谱拮抗放线菌,经鉴定放线菌G5和G43均为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei),G108为仙台链霉菌( Streptomyces sindenensis)。(3)盆栽试验表明,娄彻氏链霉菌孢子粉对马铃薯有促生作用并能提高其抗逆性。拌土和包衣接种娄彻氏链霉菌孢子粉后,处理马铃薯地上鲜质量较对照分别增加19.0%和7.5%;生长期株高较对照分别增加7.3%和9.5%,基部茎周长较对照分别增加10.7%和4.1%;丙二醛MDA含量分别降低11.6%和25.2%。表明该菌对马铃薯生长有促进作用,并能提高植株的抗逆性。     

Isolation and characterization of Bacillus subtilis EB-28, an endophytic bacterium strain displaying biocontrol activity against Botrytis cinerea Pers.

The fungal pathogen Botrytis cinerea Pers. causes severe rotting on tomato fruits during storage and shelf life. As a biological control agent, endophytic bacterium was regarded as an effective alternative to chemical control. Out of 238 endophytic bacterial isolates, three strains (EB-15, EB-28, and EB-122) isolated from Lycopersicum esculentum Mill., Speranskia tuberculata (Bge.) Baill, and Dictamnus dasycarpus Turcz. respectively were found to be strongly antagonistic to the pathogen in vitro and were selected for further in vivo tests. One endophytic bacterium strain, encoded EB-28, was selected from the three in vivo tested isolates. The inhibitive rate of EB-28 reached 71.1% in vitro and 52.4% in vivo. EB-28 was identified as Bacillus subtilis according to its morphological, physiological, and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.     

中草药日本鸢尾内生真菌的分离及其初步鉴定

目的 分析日本鸢尾（Iris japonica）内生真菌的类群分布。方法 通过菌落形态特征、显微镜下的孢子观察及基于ITS序列分析的分子生物学鉴定分析日本鸢尾各部位内生真菌的类群组成。结果 从日本鸢尾的根茎叶中共分离得到5种内生真菌。根中分离得到的内生真菌为橘青霉（Penicillium citrinum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,茎中为小新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）,叶中为橘青霉（Penicillium citrinum）、肉色隔孢伏革菌（Peniophora incarnata）、首都叶点霉（Phyllosticta capitalensis）。结论 自日本鸢尾分离获得5种内生真菌,其分布具有一定的组织特异性,可为药用植物内生真菌的开发和利用提供一定基础。     

耐盐植物虎尾草内生解烃细菌的筛选及其降解特性

从耐盐植物中分离具有石油烃降解功能内生细菌并研究其降解特性,为内生细菌协同宿主植物修复石油污染盐渍化土壤提供基础。以黄河三角洲长期受石油污染重盐碱地生长的耐盐植物虎尾草为材料,分离出能以柴油为唯一碳源生长的内生细菌24株。通过柴油降解试验,筛选得到1株高效石油烃降解内生细菌BF04。经生理生化特性及16S r DNA同源序列分析,确定BF04为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。通过液体培养试验研究了BF04对不同烃的利用能力和对柴油的降解动力学特征。结果表明:BF04能够利用直链烷烃、支链烷烃和单环芳烃,不能利用多环芳烃和苯酚。BF04能降解柴油中大部分烷烃,其中对短链烷烃(n C11~n C23)降解率高于长链烷烃(n C24~n C27)。BF04对柴油降解可以用一级反应动力学模型表示。在含有3%Na Cl的液体培养基中,BF04具有较强的降解柴油能力,在修复石油污染高盐环境中具有一定的应用潜力。     

多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究

多花黄精是一种著名的中药材，其药用部位（根茎）含有多种内生真菌，是新化合物、新药源和生防制剂的潜在资源。为研究黄山市祁门县多花黄精根茎内生真菌的物种多样性，为其开发利用提供种质资源，采用组织分离法分离培养多花黄精根茎内生真菌，通过经典形态分类学并结合rDNA ITS序列比对鉴定分离得到的真菌，并进行物种多样性分析。结果表明，从多花黄精根茎中共分离出182株内生真菌，经鉴定为2门、5纲、13目、28科、33属和49种，另外有4株未确定其分类地位。其中子囊菌门(Ascomycota)为优势门，分离频率为83.52％；粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势纲，分离频率为59.34％；肉座菌目(Hypocreales)为优势目，分离频率为46.70％；优势科是麦角菌科(Clavicipitaceae)，分离频率为33.52％；Metapochonia是优势属，分离频率为33.52％。物种多样性研究结果表明黄山市祁门县多花黄精根茎的内生真菌物种丰富，群落结构复杂，且春季的多花黄精根茎内生真菌的Shannon-Wiener指数、Pielou均匀度指数、Simpson优势度指数和丰富度指数均高于夏季。     

放线菌Wa-13868的分类鉴定及其代谢产物的研究

在新农用抗生素的筛选过程中,分离到一株具有良好生物学活性的放线菌.经测定,其代谢产物对多种病原真菌及害虫、杂草靶标有良好的活性.时产生菌进行常规分类鉴定及分子鉴定后,确定其为壮观链霉菌(Streptomyces spectabils)的一个菌株.对发酵液中的活性物质进行了提取,生物测定,经HPLC及MS分析,根据紫外光谱、分子量及碎片峰的分析,确定其活性物质为巴菲霉素.     

盐碱土壤中唐古特白刺内生真菌分离与鉴定

为探明唐古特白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）的内生真菌种属及其组织分布特性,采用传统组织块法从生长于盐碱土壤的白刺中分离内生真菌,运用形态学和真菌ITS序列分析进行种属鉴定,并通过MEGA7.0构建系统发育树。结果显示,从白刺（根、茎、叶）分离得到23 株内生真菌,共鉴定出21 株,其中链格孢属（Alternaria）13 株,毛壳菌属（Chaetomium）1株,篮状菌属（Talaromyces）3 株,细基格孢属（Ulocladium）4 株,主要分布于唐古特白刺的根部,叶次之,茎则无。表明白刺内生真菌分布具有组织差异,根是其侵染和定殖的主要部位。     

两株生防芽孢杆菌的分子鉴定及拮抗活性测定

对两株分离自青海年宝玉泽及玛多高寒草甸根围土壤的拮抗菌株GL18和MD1进行鉴定分析。生理生化试验鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌群;16SrDNA分子鉴定表明,菌株GL18、MD1与Ba-cillus methylotrophicus及Bacillus amyloliquefaciens的序列相同(或一致)性均为99%;gyrB分子鉴定表明,菌株GL18、MD1与B.methylotrophicus具有最高序列相同(或一致)性;以两株菌株的16SrDNA及gyrB基因序列与模式菌株序列构建系统发育树,结果表明,两株菌株均与B.methylotrophicus具有更近亲缘关系;综合几种鉴定结果最终将菌株GL18、MD1鉴定为B.methylotrophicus。平板对峙试验表明,菌株GL18和MD1对油菜菌核菌具有显著拮抗活性;油菜离体叶片接种试验表明,菌株对油菜菌核病菌的侵染具有较好的防效。