H9N2亚型禽流感病毒灭活苗最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究

H9N2亚型禽流感疫苗在我国普遍使用,在强大免疫压力下,H9N2亚型禽流感病毒变异加快,现有商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒流行株的感染。为此,本研究以从近期流行毒株中筛选出的一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)(简称为SH441)为种毒,制备灭活苗,进行了最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究。将制备的H9N2亚型禽流感灭活苗以0.01、0.02、0.04、0.05、0.08 mL/只的不同剂量,胸部肌肉途径免疫3周龄SPF鸡只,并于免疫后21天静脉感染SH441病毒,结果显示该疫苗最小免疫剂量为0.02 mL/只。以0.05 mL/只剂量免疫SPF鸡只,该疫苗能刺激SPF鸡只产生较高的HI抗体滴度,且在免疫后第5周达到峰值(12 Log2以上),随后稍有下降但保持相对稳定,且在免疫后29周时依然保持在7 Log2以上。这些结果为为该疫苗的进一步开发奠定了良好的基础。     

悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫剂量试验

为研究由悬浮培养的MDCK细胞制备的H9亚型AIV抗原所制备的灭活疫苗的免疫剂量,在生物反应器中悬浮培养MDCK细胞,接种H9亚型禽流感病毒WD98和HN04种毒,收获抗原液,以2种抗原液分别制备2个毒株的单价油佐剂灭活疫苗。每种疫苗均按照0.3、0.2、0.1、0.05mL/只(107.5 EID50/只~105.52 EID50/只)的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AIV的HI抗体,采血后分别用与制苗株同源的H9亚型AIV种毒静脉注射攻毒,测定疫苗保护率。2种疫苗不同剂量免疫接种后21d的AIV HI抗体水平达到3.8log2~5.6log2,对照组鸡AIV HI抗体均为0log2。攻毒试验证实,以105.52 EID50/只~107.5 EID50/只剂量进行免疫接种,免疫鸡只获得了80%以上的保护。按照兽药典H9亚型禽流感疫苗攻毒保护率90%为合格的标准,悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的最小免疫接种剂量为106.82 EID50/只。     

悬浮MDCK细胞源与鸡胚源H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较研究

为探讨MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果,使用10日龄SPF鸡胚和MDCK纯悬浮细胞分别接种H9亚型禽流感 BX13株病毒,收获抗原液,制备2种单价油佐剂灭活疫苗,按照不同免疫剂量对21日龄SPF鸡进行免疫接种,测定免疫后不同时间的血清HI抗体,免疫后21 d翅静脉攻毒,测定疫苗的保护率。结果表明：2种疫苗分别以0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡后,7 d HI抗体均为0log2,免后14 d、21 d时2种疫苗相同免疫剂量组间HI抗体无明显规律性差异。免疫后21 d,2种疫苗0.1mL/只～0.3mL/只的免疫剂量,各组间HI抗体水平无明显差异,可以达到1∶128以上。攻毒试验表明,鸡胚源疫苗0.1 mL/只、MDCK细胞源疫苗0.2mL/只的免疫剂量可以达到10/10保护。本研究为使用MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的深化研究和应用奠定了基础。     

禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗不同剂量的免疫效果比较

将47只28日龄SPF鸡分为4组，第1～3组为试验组，每组12只，分别肌肉注射禽流感H9亚型灭活油乳剂疫苗0．1、0．3、0．5mL／只，第4组11只为对照组。各组鸡在免疫后1、2、3周采血，测定H9抗体水平；在免疫后3周用1：10稀释的AIV H9N2攻毒，0．2mL／只。攻毒后第2、3、4周继续测定H9抗体水平，观察了疫苗对鸡的保护效果。结果显示，0．5mL／只剂量的免疫效果比0．1mL／只和0．3mL／只剂量的免疫效果好；攻毒用的AIV H9N2的致病力低，对所有试验鸡均不致死。     

基于悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)安全性和免疫产生期研究

为探讨悬浮细胞制备的鸡新城疫-H9亚型禽流感二联灭活疫苗(La Sota株+BX13株)(以下简称二联灭活疫苗)的安全性和免疫产生期，试验用新城疫病毒(NDV)La Sota株和H9亚型禽流感病毒(AIV)BX13株分别接种BHK-21和MDCK悬浮细胞，收获抗原液，制备二联灭活疫苗；采用1 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡进行二联灭活疫苗的安全性试验；以0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡，免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIVHI抗体，并于免疫后21日龄攻毒进行免疫保护试验和免疫产生期试验。结果显示：二联灭活疫苗对SPF鸡安全，鸡只无不良反应，疫苗吸收良好；各剂量组免疫后抗体水平均逐渐升高，免疫后21 d NDV HI效价为6.1～8.5 log₂,AIV HI效价为7.5～11.2 log₂；免疫后21 d,0.02 mL/只剂量组对两种毒株的攻毒保护率均为9/10，其余剂量组均为10/10保护。研究表明，二联灭活疫苗对SPF鸡安全，以0.1 mL/只的剂量免疫SPF鸡21 d可...     

重组禽流感病毒(H5N2)的拯救及其生物学特性分析

为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对禽流感H9亚型流行株攻毒的保护作用

为了监测鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(LaSota株+M41株+SS/94株)对H9亚型禽流感病毒流行毒株的免疫保护效果,采用H9亚型禽流感病毒SS/94株及2009—2010年现地分离的3株H9亚型禽流感病毒对已免疫上述三联灭活苗的SPF鸡进行攻毒试验。结果显示,试验鸡以0.3 mL/只的剂量免疫三联灭活苗后21 d,其H9亚型禽流感病毒的HI抗体效价可达8～11log2,此抗体水平可抵抗2×106EID50的H9亚型禽流感病毒SS/94株、BLCN09株、WDZ09株、YT10株的攻击,攻毒保护率均达90%(9/10)以上。可见,以SS/94株作为禽流感疫苗抗原制备的三联灭活苗具有良好的免疫原性,能使免疫鸡抵抗2009—2010年期间现地分离的多株H9亚型禽流感病毒的攻击。     

H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株灭活疫苗的研制

利用H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株进行灭活疫苗的研制,并对疫苗的免疫效果进行评价,为家禽H7N9亚型流感的防控提供科学数据及手段。将AIV-rGD76株用灭菌生理盐水作104倍稀释后,接种11日龄非免疫鸡胚,37℃孵育72h后收获感染鸡胚尿囊液,经甲醛灭活后,加矿物油佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗,对制备疫苗的性状、安全性、免疫效力等进行检验。结果显示,制备的3批重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株)均为油包水型,黏度均在50cP以内,对3批疫苗取样,样品经3000r/min离心15min,管底无水相析出。安全性试验结果显示,将疫苗按1mL/只超剂量接种3周龄SPF鸡,试验鸡在观察期内全部健活,未出现局部或全身不良反应,表明疫苗对SPF鸡具有良好的安全性;免疫效力及攻毒保护试验结果显示,用疫苗按0.3mL/只的剂量免疫接种3周龄SPF鸡1次,免疫接种后21d试验鸡血清中rGD76株的HI抗体平均效价可达8log2以上,使用H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD16株滴鼻接种0.2mL/只(含100LD50)对免疫鸡进行攻毒,疫苗对免疫鸡的保护率均为100%。在实验室条件下研制出重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株),疫苗的各项指标均符合标准。     

鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的研究

为研制鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI,H9亚型)三联灭活疫苗,用新城疫病毒(NDV)La Sota株及H9亚型禽流感病毒(AIV)WD株分别接种易感鸡胚培养,用传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJQ902株接种DF-1细胞培养,收获病毒液,经超滤浓缩、甲醛灭活后,加入油佐剂乳化制成3批疫苗。对3批制品进行了检验,其性状检验、装量检查、无菌检验、甲醛、汞类防腐剂残留量测定均符合要求,鸡对疫苗无任何不良反应。效力检验结果显示:ND部分以20μL/只剂量免疫,血凝抑制(HI)效价达5.6~6.1 log_2,攻毒后均能提供100%保护;IBD部分以0.5 mL/只剂量免疫,中和抗体效价达16.0~16.4 log_2,攻毒后均能提供100%保护;AI(H9亚型)部分以0.3 mL/只剂量免疫,HI效价达8.7~9.0 log_2,攻毒后均能提供100%保护。试验结果证实,研制的疫苗安全、免疫效力高。     

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒.结果显示,免疫后21 d,HF株灭活疫...