重组酶Xar的表达纯化及性质研究

为获得高效的半纤维素类饲料酶制剂,将含嗜热厌氧乙醇菌α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶(Xar)基因的重组质粒p ET-20b-xar导入大肠杆菌DH10B中,经IPTG诱导进行高效表达,将表达的重组酶进行热处理和Ni~(2+)亲和层析纯化,并对纯化的重组酶Xar的性质进行研究。结果表明,以对硝基苯酚-α-阿拉伯呋喃糖苷(p NPAF)为底物,重组酶Xar的最适反应温度和最适p H值分别是75~80℃和6.0,米氏常数(Km)、最大反应速度(Vmax)分别为2.42 mmol/L、20.7μmol/(min·mg);以对硝基苯酚-β-木糖苷(p NPX)为底物,重组酶Xar的最适反应温度和最适p H值分别为93℃和5.8~6.2,Km、Vmax值分别为0.60 mmol/L、43.8μmol/(min·mg)。将重组酶Xar置于80℃保温1 h,木糖苷酶的相对活性仍为56.4%,在p H值4.2~8.2条件下仍保持较高的稳定性。当木糖浓度达到400 mmol/L时,木糖苷酶的相对活性仍有97.9%。Mn~(2+)对重组酶Xar有明显的激活作用,而Cu~(2+)和Zn~(2+)对其有明显的抑制作用。可见,重组酶Xar具有良好的热稳定性。     

康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

康氏木霉GIMP3.444经摇瓶发酵,获得分泌到胞外的纤维素酶,粗酶液经(NH4)2SO4分级沉淀、Sephacryl S200凝胶过滤层析、DEAE Sepharose FF离子交换层析及Octrl Separose CL-4B疏水层析分离纯化出一种内切型的β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,BIO-RAD分析相对分子量为61.8 ku。该内切β-葡聚糖苷酶的最适反应温度为55℃,最适反应p H值为4.4,作用于羧甲基纤维素钠时,Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分别为4.81 mg/m L、2.48 mg/(min·m L)。     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

多功能融合酶基因Linker的优化及表达

在融合酶阿拉伯/木糖苷酶-木聚糖酶(Xar-xynA)之间插入不同组成和长度的多肽Linker,避免催化结构域相互之间的干扰,改善融合酶的催化效率。5个含不同长度及Ala/Gly比例连接肽Linker的融合突变体在大肠杆菌重组表达、纯化,并对融合酶的酶学性质、动力学参数和酶解作用进行研究。结果表明,融合酶Xar-L1/L2/L3-xynA和融合酶Xar-xynA有着相似的最适温度和最适pH值。其中融合酶Xar-L1-xynA在65~80℃和pH值6.6~8.2有更强的阿拉伯/木糖苷酶热稳定性和pH值稳定性,将融合酶Xar-L1-xynA在65℃保温60 min其阿拉伯/木糖苷酶活性有着明显的激活现象。并获得连接Xar和XynA的最优Linker:L1和L4,麦麸和玉米芯木聚糖产物酶解试验的结果表明,融合酶Xar-L1-xynA和Xar-L4-xynA比其他的融合酶有着更高的催化效率。     

灰绿青霉阿魏酸酯酶的分离纯化和酶学性质研究

[目的]研究青霉(Penicillium glaucum)XGY36胞外产阿魏酸酯酶的纯化和酶学性质。[方法]菌株胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析、Sephadex-G75分子筛层析进行纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对其酶学性质进行研究。[结果]从菌株发酵液中分离纯化到电泳纯的阿魏酸酯酶,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。阿魏酸酯酶经SDS-PAGE获得1个条带,其表观分子量为36.5 ku。催化底物阿魏酸乙酯的最适反应温度为50℃,最适p H为5.0。阿魏酸酯酶在60℃以下和p H 3.0~7.0范围内稳定。金属离子Zn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)对酶有明显的激活作用,而Pb~(2+)、Hg~(2+)和Ag+对阿魏酸酯酶有强烈的抑制作用,Na+、K+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Fe~(2+)对酶活的影响不大。[结论]青霉阿魏酸酯酶具有潜在的应用价值,适合应用于食品、医药及生物等领域。     

阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性

阿拉伯糖苷酶／木糖苷酶是木聚糖类半纤维素生物降解和转化所必需的酶类。本文在国内首次报道对该酶的研究：通过PCR从产乙醇热厌氧杆菌Thermoanaerobacter ethanolicus JW200克隆出编码高度热稳定性阿拉伯糖苷酶／木糖苷酶的基因，与组氨酸标签融合，以高拷贝质粒pAlter-Exl在大肠杆菌中得到高效表达；基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后，酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明，得到的阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4．2～8．2之间酶活力稳定，75℃的半衰期为1h；β-木糖苷酶在pH5．0～8．2之间有较高的稳定性，酶1h半衰期温度为84℃。     

绿色木霉非专一性产双功能酶的鉴定

[目的]对绿色木霉诱导产生的具有壳聚糖和纤维素降解活性的双功能酶组分CCBEⅡ进行酶学性质研究和酶类鉴定。[方法]采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定CCBEⅡ的壳聚糖酶和纤维素酶活力,对酶的温度、pH值稳定性、底物特异性、金属离子影响等酶学性质进行研究。[结果]双功能酶CCBEⅡ作用壳聚糖和羧甲基纤维素钠(CMC)的最适温度均为60℃,最适作用pH值分别为5.2和4.2。金属离子Mn2+、Mg2+对酶的2种活性都有激活作用,Fe3+、Cu2+、Ag+和Hg2+则能强烈抑制2种酶活。CCBEⅡ对CMC和壳聚糖(84%脱乙酰度)显示出相当的降解活力,而对对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷无降解活性;以二糖方式切割CMC,而以单糖形式切割壳聚糖,可以水解GlcN-GlcN和GlcNAc-GlcN键或GlcN-GlcNAc键。经鉴定,CCBEⅡ与糖苷水解酶7族的绿色木霉所产的CBHⅠ(gi|295937)序列具有很高的同源性,二级结构以β-折叠为主。[结论]双功能酶CCBEⅡ与从商品纤维素酶制剂中纯化的双功能酶性质基本一致,两者为同一蛋白;经鉴定实际为具有外切壳聚糖酶活性的CBHⅠ,属于糖苷水解酶7族。     

一种康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为获得康氏木霉(Trichodermakoningii)内切β-葡聚糖苷酶组分,并研究其酶学性质,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对康氏木霉GIMP3.444纤维素酶主要组分进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测蛋白质纯度和分子量,MALDI-TOFMS鉴定蛋白质种类。结果显示,从康氏木霉所产的纤维素酶系中分离纯化获得一种内切β-葡聚糖苷酶组分,相对分子质量为44 600,酶的比活力为19.65 U/mg。该内切酶的最适反应p H值为4.5,最适反应温度为55℃。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物时,酶的米氏常数(Km)为7.22 mg/ml。不同金属离子对酶活性影响不同,其中Ca2+(0.3 mmol/L)对酶的抑制作用较强,抑制了近35%的活力。通过MALDI-TOFMS鉴定及数据库分析,确定该酶为一种新的内切β-葡聚糖苷酶组分。     

纤维素降解菌中葡聚糖酶基因的克隆表达及活性

为探明约氏梭菌(Clostridium josui)中纤维小体内某个酶的功能性,从该菌属CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C,大小为1943 bp,编码647个氨基酸,将该基因构建于大肠杆菌表达载体p ET28a(+)中,获得重组表达载体p ET28a-Cel9C,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达。结果表明,该酶的最适反应温度为45℃,最适反应p H为p H6.0;对大麦-β-葡聚糖(Barley-β-glucan)和魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan)具有较高的反应活性,比活值分别达到114和57 U·mg-1;几乎不能以木聚糖(Brichwood xylan)和半乳甘露寡糖(Galacto mannan)为底物。说明该酶对葡聚糖类物质时有较高的降解能力,应为葡聚糖酶。     

黑曲霉变种RM48 α 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究

    经硫酸铵沉淀、疏水柱层析和分子筛层析,从黑曲霉变种RM48(Aspergillus niger v.Tiegh RM48)固体发酵后的浸提液中分离纯化了α-半乳糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,此酶蛋白的分子量约为108 kDa.酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度是60℃,耐热温度为40℃:最适反应pH为4.5,在pH 3.0～6.0之间保持90%以上的酶活性;在实验的金属离子范围内,所有金属离子对黑曲霉变种RM48α-半乳糖苷酶均有抑制作用,其中Cu2+和Fe2+抑制作用最为显著,Li2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Ca2+,Mg2+和Co2+对酶活性有轻微的抑制作用.在pH 4.0和60℃反应条件下此酶的Km为7.37mm01·L-1,Vmax为5618 IU·mg-1·min-1.成熟酶蛋白N端序列为DEKAYSPCYY,与已报道的α-半乳糖苷酶蛋白无同源性.     

杏鲍菇菌糠漆酶分离纯化及部分酶学性质研究

为寻求制取漆酶廉价的原料,实现杏鲍菇菌糠资源高值化利用,以杏鲍菇菌糠为材料,采用硫酸铵分级沉淀、冷冻干燥和DEAE-sepharose柱层析技术分离纯化漆酶并对其酶学性质进行研究。结果表明:经Native SDS-PAGE检测所得漆酶为单一纯品,分子量大小约为44.3 ku,酶比活6.233 U/mg,纯化倍数10.452,酶活回收率16.640%;该酶氧化ABTS的Km值为0.087 mmol/L,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为40℃,低于35℃时有较好的热稳定性,最适p H为3.8,在p H 3.8~4.6表现出较强的稳定性;金属离子Fe2+、Cu2+对漆酶有明显抑制作用,而Fe3+、Mn2+有显著促进作用。     

绿色木霉Fn10-1纤维素酶的分离纯化及酶学特性测定

试验研究了绿色木霉Fn10-1纤维素酶的初步纯化及酶学性质开展研究。结果表明,该纤维素酶的最适催化温度为70℃,最适pH 7.6,在温度为4~50℃下均能保持较稳定的酶活,高于50℃以后,热稳定性变差,酶活力开始急剧下降。pH在5.6~7.6时该酶有较好的稳定性。Na+、Mn2+、Fe2+、Mg2+、Co2+、Ca2+、Ba2+、Al3+对纤维素酶具有一定的激活作用,Ag+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、K+对该酶有一定的抑制作用,其中Cu2+的抑制作用尤为明显。     

绿色木霉内切纤维素酶的分离纯化及酶学性质的研究

绿色木霉AS3.5455经固体发酵,提取胞外纤维素酶,经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE Cellulose-52离子交换层析、SephadexG-150凝胶柱层析等纯化出单一组分的内切β-葡聚糖苷酶,经SDS-PAGE电泳分析,该内切酶的相对分子量约为58.7KD,内切β-葡聚糖酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH为5.5。     

一株木霉菌(Trichoderma sp.)TY2纤维素酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

[目的]筛选高活力纤维素酶产生菌,高效利用纤维素资源.[方法]从朽木和和纸浆样品中分离筛选出一株产纤维素酶活较高的菌株TY2.对其形态和18S rDNA特征序列分析鉴定为木霉菌(Trichoderma sp.).对菌株发酵条件及酶学特性进行研究.[结果] TY2菌株的最佳产酶条件为:1;滤纸+2;麸皮+0.5;葡萄糖为碳源,0.5;蛋白胨为氮源,起始pH 5.0,温度28 ℃,200 r/min,5 d,其CMCase和FPase活力分别达412.5 和100.3 U/mL.经分离纯化出TY2菌株内切β-葡聚糖苷酶.内切β-葡聚糖苷酶最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为4.6,在50 ℃以下,pH 3.0～5.0,酶活性稳定,且在80 ℃仍具有降解CMC-Na的效果.同时研究发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对内切β-葡聚糖苷酶的酶活有促进作用,而汞离子有明显的抑制作用.[结论]所筛选的TY2菌株具有潜在的工业应用价值.     

Neosartorya fischeri P1来源的外切聚半乳糖醛酸酶异源表达及性质研究

聚半乳糖醛酸酶在食品和饲料行业具有很大的应用价值,发现新的聚半乳糖醛酸酶不仅能够补充该酶的相关信息,还能为工业应用提供更多选择。从一株嗜热费希新萨托菌(Neosartorya fischeri P1)的基因组中克隆得到一个外切聚半乳糖醛酸酶基因(Nf-pg),将Nf-pg在毕赤酵母GS115中进行异源表达,重组酶Nf-PG纯化后进行性质测定。Nf-PG在p H 4.5和55℃时活性最高,在p H 2.0~9.0具有较好的稳定性,50℃热处理60 min仍能保持80%的剩余酶活;去除N-糖基化的酶蛋白Nf-PG-D最适温度为50℃,热稳定性降低,最适p H和酸碱稳定性无明显改变。产物分析证明Nf-PG是严格的外切聚半乳糖醛酸酶,优异的性质使其成为食品加工行业的良好选择。     

β-甘露聚糖酶异源表达及甘露寡糖制备研究

以产β-甘露聚糖酶(MAN)的枯草芽孢杆菌HD145为目的菌株,PCR扩增MAN基因片段,克隆到p HBM905A载体并转化至毕赤酵母,重组子利用甲醇进行诱导。纯化的MAN酶解槐豆胶与瓜尔豆胶,质谱检测水解产物。SDS-PAGE结果表明,MAN基因实现了表达,摇瓶酶活性为3 200 U/m L,酶最适温度与pH分别为55℃与6.0,pH 4~7时稳定性较好,在40、50、60℃的半衰期分别为165、105、42 min,Zn~(2+)、Ag~+、Co~(2+)对酶活性存在一定的抑制。槐豆胶与瓜尔胶经MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。     

一种新的镰刀菌Q7-31木聚糖酶Xyn9的分离纯化鉴定及酶学特性

为对植物病原菌镰刀菌(Fusarium sp.)Q7-31所产木聚糖酶进行鉴定及酶学特性分析,在发酵产酶培养基上对Q7-31进行发酵培养,获得能够高效降解植物细胞壁的粗酶液。然后,采用Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化后得到木聚糖酶Xyn9,并对其开展蛋白质组学研究和酶学特性分析。结果表明:粗酶液中木聚糖酶比活为16.58 U/mg,纤维素酶比活为0.428 U/mg,细胞壁降解酶比活为0.019 8 U/mg,蛋白含量为2.17 mg/m L。Xyn9的蛋白质组学研究结果显示,其分子量为21 ku、等电点为6.86,接近GH10家族。纯化后Xyn9的酶学特性表明,最适反应温度为47℃,最适p H值为5.6,该酶在33℃以下和在p H值5~6的范围内较稳定;金属离子K+对该酶有激活作用,Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+抑制该酶活性,Cu2+、Hg+使该酶完全失活。综合Xyn9的分子量、蛋白质组学结果以及酶学特性,最终将其鉴定为一种新的介于GH10家族与GH11家族之间的内切木聚糖酶。     

来源于土壤宏基因组中漆酶Lac13H9基因克隆及其酶学性质分析

漆酶广泛存在于土壤中,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从土壤宏基因组中得到了一个全长为1 389 bp漆酶基因lac13H9,编码462个氨基酸,预测理论分子量为50 k Da,含有一个17个氨基酸组成的信号肽,与NCBI蛋白数据库比对结果表明是一个新的漆酶基因。将lac13H9转入到大肠杆菌Transseta(DE3)中通过微好氧发酵进行异源表达,并通过Ni柱亲和层析纯化。获得的重组漆酶Lac13H9具有良好的酶学性质,其最适温度为40℃,最适p H为6.0,且具有较好的热稳定性,在50℃下保温90 min还有60%的剩余酶活力,同时发现低浓度的Fe2+促进漆酶酶活,高浓度则抑制酶活。良好的酶学性质为该酶的应用奠定了基础。     

β-葡萄糖苷酶纯化及酶学性质研究

研究了来源于曲霉No.5.1的β-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-chitopearl和Sephadex G-100柱层析得到纯β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE凝胶电泳显示一条带,测得分子量为67.5 kD。该酶最适反应pH6.0,最适反应温度为60℃,在80℃以下、pH3.0~9.0酶活力相对稳定。K 、Na 、Mg2 和Zn2 对酶有激活作用,而Ag 和Fe2 对酶具有明显的抑制作用。该酶对纤维二糖和水杨素的水解能力最强,水解水杨素的Km值为3.09 mmol/L。     

1株饲用木聚糖酶产生菌的分离、鉴定、发酵、酶学性质及应用

以木聚糖为唯一碳源,从长期堆放枯枝败叶的土壤中筛选能够高效降解木聚糖的菌株,并对该菌的产酶条件和酶学性质进行研究。分离得到1株酶活性较高且产酶相对稳定的菌株,鉴定为尖孢镰刀菌,命名为Fusarium oxysporum MJ23。研究表明,木聚糖、酵母粉是该菌的最适培养底物,在最适培养条件下,该菌株所产木聚糖酶活力可达186 U/mL;木聚糖酶的最适作用温度、pH值分别为55℃、6,55℃保温3 h,酶活力仍可维持90%以上;Ca2+、Fe2+、Mn2+、Tween 80和聚乙二醇对木聚糖酶活力有较强促进作用,Cu2+、Zn2+、EDTA、尿素和SDS则会抑制酶活,其中SDS的抑制作用最强。模拟动物体内对饲料中半纤维素组分的消化,木聚糖酶的添加可使猪饲料中木糖生成量提高28%,鸡饲料中木糖生成量提高16%,表明该菌株所产木聚糖酶具有用作饲料添加剂的可能性。