利用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分研究

[目的]建立一种快速准确的鸭源性成分检测方法.[方法]分别以线粒体16S rRNA基因和COⅠ基因序列为靶位点设计鸭特异性引物,以常见畜禽肉(羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉)DNA为模板,进行PCR扩增,检测引物的特异性和灵敏度.[结果]筛选的引物能够有效地对鸭源性成分进行检测,方便简洁,灵敏度较高.[结论]该方法能够快速有效地鉴别畜禽肉中鸭源性成分.     

利用PCR和限制性酶切技术鉴别3种鳗鱼

根据日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗3种鳗鱼的16S rRNA基因序列,设计特异性引物,进行16SrRNA基因的PCR扩增,然后对PCR产物进行ApaI酶切反应.结果显示,日本鳗和欧洲鳗的PCR产物均出现211 bp的特异性扩增条带,美洲鳗的PCR产物出现两条DNA条带;日本鳗的PCR产物经ApaI酶切产生大小为135 bp和76 bp的两条条带,而欧洲鳗的PCR产物经ApaI酶切没有变化.因此,利用该方法可鉴别出日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗等3种鳗鱼.     

猪源性成分的PCR检测技术优化研究

为确定食品和饲料中的猪源性成分,本试验优化了PCR检测猪源性成分的反应体系.试验采用20 μl的PCR反应体系,分别测定Taq DNA聚合酶为0 U、1 U、2 U、3 U时;25 m mol/L的MgCl2为0、2、4、6μl时;dNTP为0、0.1、0.2、0.4μl时,其他PCR反应因素为最大量的结果.结果表明:优化的猪源性成分PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、dNTP适宜浓度分别为2 U,2μl,0.4μl.优化后的反应体系对猪肉DNA最低检测浓度为0.04ng/μl.本研究优化出的猪源性成分PCR反应体系经二重PCR反应技术进行验证,不仅快速,简便,准确性与灵敏度高,并且经济、高效.     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

基于多重PCR技术同时检测肉制品中6种动物源性成分

为建立一种检测肉制品中6种动物源性成分(牛、羊、鸡、猪、鸭和驴等)的多重PCR方法,比较了3种DNA提取方法,设计筛选了6对引物并对其特异性进行验证,同时对影响多重PCR扩增效率的因素(引物比例、退火温度和镁离子浓度等)进行优化.结果表明:试剂盒法为最佳的DNA提取方法;多重PCR法最优反应条件:引物比例为牛∕羊∕鸡∕...     

肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及应用

建立了驴源性成分的快速分子检测方法,确立了1对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR,扩增目的片段的长度是294 bp,经验证引物对驴源性成分的特异性良好,确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认,所得181、113 bp片段与分析结果一致。利用该方法对市售样品进行检测,检测结果准确。     

双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌

根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,可从分子水平上确定这些样品为无乳链球菌,与生化鉴定结果一致.     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

基于TaqMan PCR鉴定猪源性成分的引物和探针研发

为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。     

应用PCR-RFLP法鉴别肉制品中的猪和牛源性成分

以动物线粒体DNA中Cytb区段的保守序列为目的基因进行PCR-RFLP,从猪、牛、羊、鸡、鸭、兔6种生肉及高压猪肉、猪肉火腿肠、猪肉枣、猪肉松、牛肉干、牛肉枣、牛肉火腿肠7种加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成分.所有样品经PCR扩增均产生359 bp的片段.扩增子采用AluⅠ限制性酶切所产生的片段差异可用于区分猪肉和牛肉.     

酶解畜禽骨肉的研究进展

[目的]介绍酶解法利用畜禽骨肉的研究进展。[方法]通过分析国内外酶解畜解禽骨肉的研究现状,指出了酶解研究中存在的问题,同时对今后的研究方向进行了探讨。[结果]酶解法已被用于利用骨蛋白及其多肽、骨钙、骨素和骨油等。但酶对骨蛋白的水解度还不高,由于酶解蛋白易产生苦味肽而使产品带有不良风味。另外,酶自身的特点也限制了它的应用范围。目前将对畜禽骨肉的酶解用于生产实践的还不多。[结论]该研究为通过酶解法合理利用畜禽骨肉提供了依据。     

食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法

【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA,通过比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法;基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别;应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法;在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。     

16S rRNA鉴定乳酸片球菌分离株

根据乳酸片球菌的16S rRNA基因序列,设计2条特异性引物,以PCR方法扩增从酸白菜中分离得到的具有抑制单核细胞增多症李氏杆菌作用的乳酸片球菌菌株的16S rRNA基因序列,经克隆和测序后,与以往发表的基因序列进行比较,同源性99%,从基因水平上进一步证明该菌株为乳酸片球菌。     

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。     

奶牛子宫内膜炎致病菌的16S rRNA序列鉴定

【目的】对奶牛产后子宫内膜炎致病菌进行16S rRNA序列鉴定。【方法】从产后子宫内膜炎患牛子宫分泌物中分离致病菌,通过细菌培养、纯化、分离、革兰氏染色和生化试验进行初步鉴定。选取代表性菌株11株,利用细菌通用引物,通过PCR方法,对其16S rRNA基因的核苷酸序列进行扩增,将扩增产物与pMD19-T载体连接构建克隆载体,经PCR和双酶切鉴定正确后测序,测序结果与GenBank中已注册菌株的16S rRNA基因序列进行比对。【结果】共分离到致病菌株60株,有代表性的11株细菌归类为:SD01为琼氏不动杆菌,SD02为粪肠球菌,SD03为金黄色葡萄球菌,SD04为中间葡萄球菌,SD05为溶血葡萄球菌,SD06为鲁菲不动杆菌,SD07为无乳链球菌,SD08为芽孢杆菌,SD09为枯草芽孢杆菌,SD10为大肠杆菌,SD11为假单胞杆菌。【结论】通过国际公认的16S rRNA序列鉴定技术,准确鉴定出引起奶牛子宫内膜炎的致病菌种类,为临床治疗该病提供了理论依据。     

温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用

为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。     

一株约翰逊不动杆菌的分离和鉴定

在土壤中分离到一株细菌STRB，该菌可以在SFM、LB、EMB、PDA、MM、MacC等多种培养基上生长，革兰氏染色为阴性，电镜观察无鞭毛。生化指标检测显示，该菌株对多数糖类不能发酵，经bioMerieux Vitek公司的革兰氏阴性细菌检测试验卡(GNI)鉴定为醋酸钙不动杆菌。设计2对简并引物对其16S rRNA进行PCR扩增，16S rRNA序列及其进化树分析结果显示，该菌为约翰逊不动杆菌。     

气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCA T)和嗜水气单胞菌(Aeromonash ydrophila)的16S rRNA基因的保守区设计2对特异性引物.通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aer...