内源性禽白血病病毒ev／J gp85基因的表达

从已构建的质粒pGEM-MTCgp85中酶切回收ev／Jgp85基因,通过构建杆状病毒转移载体pFast-Bacl-ev／Jgp85和重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev／Jgp85,将ev／Jgp85基因转入Bac-to-Bac高效真核表达系统的Sf9昆虫细胞进行真核表达。间接免疫荧光试验显示,构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞出现与野生型杆状病毒感染的Sf9细胞阴性对照明显不同的亮绿荧光;Western blot分析DAB显色,重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35ku的阳性条带。结果表明,内源性ev／Jgp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达,并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别。     

广西巴马小型猪内源性反转录病毒进化年代分析

【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒（PERV-BM）的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的 9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及GenBank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒（PERV）的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似法对筛选数据制作的遗传进化树进行分子钟行为分析。最后对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析,对符合分子钟行为的LTRs序列,以假设的恒定进化速率计算PERV-BM的进化年代。【结果】经过DAMBE软件分析后,选出80多个GenBank上发表的有代表性的env、LTRs序列数据集。对PERV-BM (HM159246) 序列全长遗传进化分析显示,PERV-BM与中国的PERV核酸序列EF133960和GU980187,荷兰的AF356697亲缘关系较近,与韩国的HQ540595和美国的AF038600和NC_003059亲缘关系则较远。利用DAMBE软件对筛选数据集替换饱和度检测结果显示,S和V值随PERV序列之间进化分歧的增加呈线性的增加。LTRs序列数据集替换饱和曲线呈线性关系,没有替换饱和现象发生,LTRs的进化随时间持续且稳定。数据集env序列替换饱和曲线不完全呈线性关系,表明env序列集进化速率不稳定。利用MEGA5.2的最大相似法对LTRs和env数据集的进化树进行分子钟行为检测结果显示,LTRs序列集接受分子钟假说,env进化不符合分子钟行为,这和不饱和度检测的结果一致。因此可用LTRs进化的近分子钟行为进行PERV进化年代的计算。利用DAMBE软件对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析结果显示,3′-LTR的进化符合分子钟行为可用于进化年代计算。假设以灵长类ERV的积累突变率,每个核苷酸每年的替换率2.3×10^-9-5.0×10^-9,计算PERV-BM约进化于3.3×10⁶-7.1×10⁶年前。【结论】PERV-BM进化年代与欧洲小型猪PERV进化时间7.6×10⁶年前相近。     

猪内源性反转录病毒5''非编码区启动子活性的分析

[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5'非编码区(5'UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5'UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5'UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5'UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5'UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5'UTR的转录活性.     

猪内源性反转录病毒5＇非编码区启动子活性的分析

[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5＇＇非编码区（5＇＇UTR）为启动子的萤光素酶表达载体,分析5＇＇UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5＇＇UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5＇＇UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5＇＇UTR的下游序列中,包括引物结合区（PBS）和前导序列（Leader）可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5＇＇UTR的转录活性.     

蛋鸡白血病的PCR检测和序列分析

采用PCR方法对某蛋鸡场送检感染鸡进行实验室诊断,针对禽白血病病毒逆转录酶3’区域设计鉴定内外源病毒共同下游引物H5,针对ALV-J亚群gp85囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物H7,A-E亚群gp85囊膜糖蛋白基因保守区域设计上游引物AD1,提取肝脏病料中核酸进行PCR扩增,测序分析结果表明为内源性禽白血病病毒感染。     

猪内源性反转录病毒5′非编码区启动子活性的分析

 【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5′非编码区（5′UTR）为启动子的萤光素酶表达载体，分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上，转染瞬时表达细胞Cos-7，检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性，U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降；U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中，包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强，同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5′UTR的转录活性。     

河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒感染状态检测

为了解河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)感染状态,采集该鸡场绿壳蛋鸡、青脚麻鸡和固始鸡的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清,利用ELISA方法检测泄殖腔棉拭子、蛋清和血清样品中的ALV-p27抗原及血清样品中ALV-A/B和ALV-J抗体的水平,同时采集其血液接种DF-1细胞进行外源性ALV的分离鉴定。结果表明,绿壳蛋鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的ALV-p27抗原阳性率分别为23.55%、11.96%和26.63%,血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为30.43%和16.85%,外源性ALV的分离阳性率为13.04%;青脚麻鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为10.99%、5.43%和22.83%,血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为18.48%和6.52%,外源性ALV的分离阳性率为8.00%;固始鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为21.07%、12.32%和25.00%,血清中ALVA/B和ALV-J抗体的阳性率分别为28.26%和17.39%,外源性ALV的分离阳性率为12.50%。表明3个地方品种鸡都不同程度地感染外源性ALV,且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染。     

J亚群禽白血病病毒TD-PCR检测方法的建立及初步应用

采用J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染DF1细胞提取的总DNA作为模板,以H5和H7为特异性引物,建立检测ALV-J的降落PCR(TD-PCR)方法,并对反应体系进行优化。结果表明:建立TD-PCR方法灵敏度高、特异性强,可检测0.105 ng的DNA,该方法与网状内皮组织增生症病毒、马立克病病毒、鸡贫血病毒及I群禽腺病毒没有交叉反应。运用TD-PCR、ELISA以及病毒分离对临床病料进行检测,TD-PCR方法与ELISA检测结果一致(100%),均比病毒分离检出率(75%)高。证明TD-PCR检测ALV-J的方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足临床、生产实际检测的需要。     

J亚型禽白血病病毒对鸡产蛋性能的影响

【目的】对四川省某鸡场鸡群进行J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染筛查,并进行ALV-J病毒感染与蛋鸡产蛋性能的相关性研究。【方法】随机抽检1 016只鸡的血样,提取总DNA,利用PCR扩增目的基因ALV-J,PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。【结果】该鸡群的感染率为10.33%;同时,ALV-J阳性个体在大部分产蛋性能方面显著低于ALV-J阴性个体:ALV-J感染组鸡的开产日龄极显著推迟5.68d(P<0.01),开产体重显著降低103.17g(P<0.05),300日龄产蛋量极显著减低14.59%(P<0.01)。同时,ALV-J阳性个体较阴性个体各时期累计产蛋量均有显著或极显著下降(P<0.01或P<0.05);且ALV-J感染鸡群产蛋高峰持续时间短,后期产蛋率快速下降。【结论】J亚群禽白血病毒ALV-J对鸡的产蛋性能造成了严重的负面影响,感染鸡只的产蛋性能显著降低,ALV-J严重制约了禽业的快速发展。     

湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为探明湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒携带情况及病毒亚型分布,应用gag,pol特异性引物,对31头湖南沙子岭猪耳部组织的DNA,RNA样品进行了PCR,RT-PCR检测,依据env基因表型env-A,env-B,env-C,鉴定了每头猪携带PERV亚型．结果表明,在所检31头个体中,93．5％的个体基因组中同时有PERV的A,B2种亚型（记为env-AB）,另外6．5％的个体基因组中则同时有PERV的A,B,C3种亚型（记为env-ABC）,所有个体的耳样组织中均未检测到单独存在的PERV的A,B或C亚型．说明湖南沙子岭猪中存在PERV序列,且能以mRNA的形式表达,病毒亚型以env-AB为主．     

湖北部分肉种鸡群J亚群禽白血病血清学调查及PCR检测

采用间接ELISA和ALV-J特异性PCR方法,对湖北省荆州市的两个肉种鸡场共94只淘汰肉种鸡进行J亚群禽白血病血清学调查和ALV-J前病毒核酸检测.两个鸡场共检测出13份ALV-J抗体阳性血清和11份核酸阳性样品,抗体阳性率分别为13.2%和14.6%,核酸阳性率分别为11.3%和12.2%.血清学调查和PCR检测结果表明,湖北鸡群已存在J亚群禽白血病.     

云南省昆明地区种鸡J亚群禽白血病血清学调查

[目的]了解云南省昆明地区种鸡场J亚群禽白血病的感染状况。[方法]从云南省昆明市疑似感染禽白血病的某种鸡场采集644份泄殖腔(公鸡)拭子和460份蛋清(母鸡)样品,采用ELISA法对种鸡J亚群禽白血病进行抗原检测。[结果]在检测的460份蛋清样品中,172份抗原呈阳性,阳性率为37.39%;在检测的644份泄殖腔拭子中,520份抗原呈阳性,阳性率为80.75%。A养殖场共检测644份样品,总阳性率为63.66%,其中蛋清样品的阳性率为39.13%,泄殖腔样品的阳性率为82.07%。B养殖场共检测460份样品,总阳性率为61.30%,其中蛋清样品的阳性率为34.78%,泄殖腔样品的阳性率为78.99%。此次检测结果表明云南省昆明地区种鸡群已严重感染J亚群禽白血病。[结论]该研究可为种鸡J亚群禽白血病的防治提供理论依据。     

江西地方品种鸡禽白血病病毒及鸡白痢沙门氏菌感染状况的研究

禽白血病毒(ALV)和鸡白痢沙门氏菌(SP)均可以垂直传播。通过禽白血病病毒(ALV)J亚群抗体和群特异性P27抗原的商品化ELISA检测试剂盒和全血平板法等调查了江西省13个种鸡企业的8个地方品种鸡群ALV和SP的感染情况,结果显示:ALV-P27抗原、ALV-J抗体均有检出,江西省地方鸡ALV-J亚型感染相当严重,迫切需要净化。江西地方品种鸡白痢沙门氏菌感染率相差较大,同一品种鸡在不同场之间的SP感染率差异明显。生物安全措施会影响鸡白痢的感染情况,在鸡白痢的净化过程中,采取严格的淘汰制度的同时,必须加强饲养管理措施来控制鸡白痢的发生。     

我国部分地方鸡种禽白血病流行病学调查

[目的]了解我国地方鸡种禽白血病的自然感染状态,为今后该病的净化提供依据。[方法]采用ELISA法和病毒分离方法,对国内10个地方鸡种开展了ALV-AB和ALV-J主要外源性禽白血病流行病学调查,并进一步对其中4个品系的F_2代鸡群进行ALV跟踪监测,同时对饲养过程中使用的弱毒活疫苗也进行了ALV抽样检测。[结果]ALV-P27抗原阳性率为0~62.1%,ALV-AB抗体阳性率为0~25.0%,ALV-J抗体阳性率为0~59.0%,病毒分离阳性率为0~22.0%。4个品系的F_2代鸡群1日龄胎粪ALV-P27抗原阳性率为6.0%~67.0%,6周龄病毒分离检测阳性率为2.0%~34.3%;国内有1个厂家2个种类2个批次的疫苗分离有ALV。[结论]我国地方鸡种普遍存在ALV感染,不同地方鸡种间差异较大,可能与不同地方鸡种对ALV的遗传抗性有关;某些品系种群的F_2代雏鸡ALV阳性率甚至略有提高,可能与疫苗接种污染有关。     

禽流感疫苗免疫商品代蛋鸡免疫抗体水平和消长规律检测

将6批次的商品代蛋鸡13 700羽分成6个试验组,用6种不同的禽流感疫苗分别接种商品代蛋鸡,疫苗免疫之后每间隔2周采血分离血清,检测禽流感H5和H9的抗体滴度和抗体持续期.结果表明HVK-2、SDYB、ZZZM三个试验组的H5抗体在免疫后的第2周达到4log2以上,CDJH和HVK-1两个试验组的H5抗体接近4log2,到第4周时,抗体滴度达到峰值,以后逐渐下降,而HVK-3试验组则几乎测不到H5抗体.H9抗体在疫苗免疫后2周全部达到5log2以上,HI抗体滴度普遍高于H5.对5组试验鸡分别进行了2次禽流感疫苗免疫,经过加强免疫的H5抗体水平普遍高于一免,并且抗体持续期明显延长.     

贫困地区内生式绿色发展路径探析

内生式绿色发展路径是适应于贫困地区经济社会发展的科学路径,也是马克思主义生态文明理论在新时期与我国经济社会发展相结合的重大创新。研究通过深入剖析贫困地区内生式绿色发展的内涵,分析总结出当前贫困地区内生式绿色发展的现实困境主要体现在物质基础总体较弱、社会矛盾较为突出、思想观念有待提升、制度体系亟待健全四个方面,并从经济、文化、社会、制度四个层面对贫困地区内生式绿色发展进行多维审视,为探索适应贫困地区实际的内生式绿色发展路径提出相应对策。     

基于转录组测序筛选鸡蛋绿壳性状相关基因

【背景】绿壳蛋深受消费者喜爱,蛋壳绿色的深浅在市场上是影响绿壳蛋定价销售的重要参考指标。绿壳蛋的形成受多基因共同调控,蛋壳绿色深浅不一,其分子机理尚不清楚。通过对赤水乌骨鸡蛋壳腺组织进行转录组测序,挖掘其调控绿壳蛋蛋壳颜色深浅的候选基因以及关键信号通路,探究影响蛋壳颜色遗传性,以期发展绿壳蛋的选种选育和提高经济效益。【目的】探讨赤水乌骨鸡的遗传基础,并通过SLCO1B3基因分型对其进行鉴定和筛选,以期通过分子标记在青壳鸡育种规划中提供新的见解,并在后期的选择策略中帮助控制和提高赤水乌骨鸡蛋壳品质的同质性。【方法】以纯系的280日龄赤水乌骨鸡为研究对象,屠宰产浅绿色蛋（QL）和深绿色蛋（SL）的母鸡各3只,采集蛋壳腺以RNA-seq技术检测分析,筛选与蛋壳颜色密切相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）,并对这些DEGs进行GO和KEGG富集分析。利用qRT-PCR技术检测与蛋壳颜色相关的6个候选基因的转录水平变化以验证转录组数据可靠性。【结果】在深绿组与浅绿组中共筛选到93个显著DEGs,有59个基因在深绿组中显著上调,34个显著下...     

禽流感病毒基因组及检测方法概述

禽流感(Avian Influenza,AI)是A型流感病毒引起的一种禽类传染病,同时也是一种人和动物之间的高度传染性疾病,不但造成了养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全构成了威胁.因此,对禽流感病毒基因组的研究显得十分重要,以为快速、准确的基因诊断等检测技术方法奠定基础.近年来,禽流感病毒检测技术发展迅速,本文...     

鸡传染性支气管炎的诊断及综合防治研究

对衡阳地区一些鸡场相继发生一种疑似NIB的疫病进行了研究。经实验室检查分离到2株病毒(H1株,W1株),根据分离毒鸡胚培养传代后的鸡胚病变、死亡及侏儒胚胎的出现以及生物学特性及幼鸡2次攻毒试验证明,2株分离毒均为NIBV,结合临床资料综合诊断为NIB。采集具有典型病变的脏器制成组织灭活苗治疗NIB,结合其它的综合措施,对衡阳地区8群共21500只发病鸡进行治疗,其死亡率分别为8%~15.8%,对照组死亡率均在32%以上,差异极显著(P<0.01)。