木薯MeP5CS1基因的克隆、表达分析及载体构建

对从木薯Ku50叶片中克隆的1个P5CS基因Me P5CS1进行聚乙二醇(PEG)、脱落酸(ABA)、盐胁迫下的表达分析,结果表明,基因Me P5CS1具有1个2 220 bp的开放阅读框,编码739个氨基酸,且含有P5CS保守结构域;Me P5CS1与杨树、杞柳的P5CS基因亲缘关系相对较近,序列相似性分别达到88.61%、88.95%;Me P5CS1基因在第1张完全展开叶、老叶中的表达量受到PEG处理诱导,且与叶片中脯氨酸的含量变化趋势一致;Me P5CS1基因的表达还受到脱落酸(ABA)、盐胁迫处理的诱导。在此基础上,成功构建Me P5CS1基因的植物表达载体p CAMBIA 2300-Me P5CS1,为进一步解析Me P5CS1在木薯抗旱中的作用机制提供参考。     

西瓜ClP5CS基因克隆及其功能研究

【目的】克隆西瓜自交系M08的ClP5CS基因(Cla006553和Cla017928)cDNA序列全长,探究其在抵御干旱和盐胁迫中的作用。【方法】利用西瓜基因组信息,以M80幼叶为材料,克隆Cla006553和Cla017928的编码序列,对其氨基酸序列进行生物信息学分析和同源分析;构建这2个基因的过表达载体转化农杆菌,采用浸花法浸染拟南芥,选取相应转基因T2拟南芥株系,检测其在脱落酸(ABA)、甘露醇、NaCl及干旱胁迫下的发芽率、根长、成活率及脯氨酸含量,研究Cla006553和Cla017928对拟南芥抗逆性的影响。【结果】Cla006553编码序列长2 166bp,编码721个氨基酸;Cla017928编码序列长2 145bp,编码714个氨基酸。Cla006553与Cla017928的核苷酸和氨基酸序列之间的相似性为分别为74.19%和77.12%,其氨基酸序列中含有ATP结合位点、脯氨酸反馈抑制位点、亮氨酸拉链、谷氨酰激酶结构域、NAD(P)H结合位点、亮氨酸结构域、谷氨酸半醛脱氢酶结构域。转Cla006553和Cla017928基因的拟南芥植株在ABA、甘露醇、NaCl和干旱胁迫下的发芽率、根长、脯氨酸含量、成活率等均高于对照,具有较好的耐旱和耐盐能力。【结论】克隆了西瓜P5CS的2个编码基因Cla006553和Cla017928,这2个基因均可增强转基因拟南芥植株的抗逆能力。     

甘蔗△^1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（ScP5CS）基因分离及其分析

以甘蔗品种ROC22为材料,待甘蔗生长至4～5叶期直接以25％PEG6000淋灌根部模拟水分胁迫。采用同源克隆与RT-PCR法从甘蔗叶片中得到甘蔗△^1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Saccharum officinarum L．△^1-pyrroline-5-carboxy late synthetase,ScP5CS）基因的编码区cDNA序列,其长度为2151bp,为一个完整的ORF,编码716个氨基酸,GenBank注册号为EU005373。核苷酸序列与前人已注册的甘蔗P5CS（EF155655）相比,同源率达到98％,但推断编码的氨基酸同源率仅为92％。该基因具有P5CS共有的结构域与结合位点：Putative ATP-binding site;Putative leucine domains;Glu-5-kinase domain;Putative NADPH—binding domain;Conserved GSA—DH domain保守区,脯氨酸反馈抑制作用位点。与前人已注册的甘蔗P5CS基因氨基酸序列（ABM30223）比较,在γ-GK保守域（Glu-5-kinase domain）内氨基酸变化较大,而与水稻、小麦的相比,其变化较小。因此,推断为甘蔗P5CS基因家族中的一个新成员。     

甘蔗Δ~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(ScP5CS)基因分离及其分析(英文)

以甘蔗品种ROC22为材料,待甘蔗生长至4～5叶期直接以25%PEG6000淋灌根部模拟水分胁迫。采用同源克隆与RT-PCR法从甘蔗叶片中得到甘蔗Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Saccharum officinarum L.Δ1-pyrroline-5-carboxy-late synthetase,ScP5CS)基因的编码区cDNA序列,其长度为2151 bp,为一个完整的ORF,编码716个氨基酸,GenBank注册号为EU005373。核苷酸序列与前人已注册的甘蔗P5CS(EF155655)相比,同源率达到98%,但推断编码的氨基酸同源率仅为92%。该基因具有P5CS共有的结构域与结合位点:Putative ATP-binding site;Putative leucine domains;Glu-5-kinase domain;Putative NADPH-binding domain;Conserved GSA-DH domain保守区,脯氨酸反馈抑制作用位点。与前人已注册的甘蔗P5CS基因氨基酸序列(ABM30223)比较,在γ-GK保守域(Glu-5-kinase domain)内氨基酸变化较大...     

SgP5CS基因克隆和生物信息学分析

利用同源克隆的方法,获得了碱蓬P5CS基因全长ORF,命名为SgP5CS。SgP5CS ORF全长2 151 bp,生物信息学软件预测其编码716个氨基酸组成的多肽,相对分子量为77 431.8 u, 等电点为5.71,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域。ClustalX多重序列比对发现SgP5CS编码的氨基酸序列与盐角草P5CS相似性为93%,与盐角草P5CS的亲缘关系最近,其次是甜菜。脯氨酸是生物体内重要的渗透调节剂,而Δ1 吡咯啉 5 羧酸合成酶则是植物合成脯氨酸的关键酶之一,SgP5CS的克隆将为进一步的功能分析鉴定基础。     

割手密铜锌超氧化物歧化酶基因(SsSOD-1a)的克隆与分析

本文以高粱超氧化物歧化酶基因(NCBI登录号为XM 002445626.1)c DNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,通过分子克隆和序列分析验证,获得了1个割手密铜锌超氧化物歧化酶基因全长c DNA序列(Ss SOD-1a,Gene Bank登录号为KJ002571)。序列全长703 bp,由624 bp的开放读码框,36 bp的5’非翻译区和43 bp的3’非翻译区组成,编码207个氨基酸。氨基酸保守结构域分析表明,该蛋白序列具有铜锌超氧化物歧化酶保守结构域,属于SOD家族。氨基酸同源性分析发现,割手密Ss SOD-1a蛋白序列与鹰嘴豆、高粱、玉米等物种同源关系较近。     

干旱胁迫下沙棘脯氨酸含量及HrP5CS基因表达分析

筛选中国沙棘全长转录组数据中差异表达的HrP5CS基因,对其进行生物信息学分析和不同胁迫下各部位表达模式的研究,同时测量叶中脯氨酸的含量。结果表明：HrP5CS基因全长为2 127 bp,编码708个氨基酸,不含信号肽,无跨膜结构的稳定疏水蛋白。与30个同源序列比对表明,氨基酸长度、理论等电点和分子质量相近;聚类分析表明,P5CS蛋白存在明显科属特性,在同科不同属内亲缘性较近;多重序列比较中,中国沙棘HrP5CS与酸枣(Ziziphus jujuba var.spinosa)亲缘性最近且序列一致性最高。荧光定量结果表明,HrP5CS基因在中国沙棘各部位特异性表达,在根和叶中总体呈上升状态,复水后下降至正常水平,在茎中第2天达到最高值后持续下降至最低值,复水后回到正常水平。脯氨酸含量随着干旱胁迫时间的持续呈阶梯式上升趋势,SPSS皮尔森相关系数分析表明,根和茎中的HrP5CS基因表达量与叶中脯氨酸含量呈正相关关系,而在叶中则呈负相关关系。以上结果说明HrP5CS基因表达和脯氨酸的积累对中国沙棘抗旱具有重要意义。     

绿竹P5CS基因的扩增及序列分析

采用同源克隆方法从绿竹基因组中获得2个P5CS基因组片段:Do P5CS1长度为2 178 bp,包含7个内含子和8个外显子,外显子编码序列为976 bp,编码325个氨基酸残基,编码蛋白分子量34.787 4 k D,等电点(PI)5.27,N端有一个氨基酸激酶超家族(Amino Acid Kinases(AAK)superfamily)功能区,C端有一个醛脱氢酶超家族(Aldehyde Dehydrogenase(ALDH)Superfamily)功能区;Do P5CS2大小与Do P5CS1外显子序列相同为976 bp,相似性达99.6%,但缺失内含子,推测Do P5CS2为返座假基因。该研究为基因全长序列的获取和功能分析以及通过分子生物学手段提高绿竹乃至其他竹类植物的抗逆性奠定基础。     

高羊茅光敏色素A基因FaPHYA的克隆与分析（英文）

以高羊茅转录组学测序获得的PHYA序列为模板,同时结合3’RACE和5’RACE方法从高羊茅中扩增出PHYA基因的全长c DNA序列,命名为Fa PHYA。该序列c DNA全长3 983 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,293~3 682 bp),编码蛋白为1 129个氨基酸,Fa PHYA的N端由GAF和Phytochrome结构域组成;C端包括2个重复的PAS结构域,1个组氨酸激酶A结构域,1个类似组氨酸激酶的ATP酶结构域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,Fa PHYA与单子叶植物PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较高,同源一致性水平达85%以上,亲缘关系较近。与双子叶植物的PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较低,亲缘关系相对较远。     

木薯ERF转录因子基因MeERF5克隆及表达分析

【目的】克隆木薯ERF转录因子基因MeERF5,并分析其在多种逆境胁迫下的表达模式,为深入研究MeERF5基因在木薯逆境胁迫应答中的调控机制提供参考。【方法】PCR扩增木薯品种华南8号的MeERF5基因编码区(CDS)全长序列,对其进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导法进行蛋白亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeERF5基因在木薯不同组织及多种逆境胁迫处理下的相对表达量。【结果】克隆获得MeERF5基因CDS序列为948 bp,与Phytozome数据库中的参考序列(登录号:Manes.01G085200.1)的核苷酸序列相似性为100.00%,其编码315个氨基酸残基,蛋白分子量为77.84 kD,理论等电点(pI)为5.08,属于酸性蛋白,其二级结构中α-螺旋占16.51%,β-转角占3.81%,无规则卷曲占62.22%,延伸链占17.46%,亚细胞定位于细胞质。通过多序列比对及系统进化分析发现,MeERF5蛋白含有1个AP2/ERF保守结构域,与同属大戟科的橡胶树ERF蛋白氨基酸序列相似性最高(76.8%),亲缘关系最近。MeERF5基因在木薯不同组织中均有表达,其中,在茎中的相对表达量最高,在腋芽中的相对表达量最低。MeERF5基因能快速响应低温胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫、盐胁迫及ABA处理,均出现诱导表达上调的现象,其中,在氧化胁迫下,MeERF5基因的相对表达量持续上升;在干旱胁迫、盐胁迫及ABA处理下,MeERF5基因的表达量先上升后降低;在低温胁迫下,MeERF5基因在处理5 h时的相对表达量达到最大值,之后有所下降,但在处理48 h时再度上升。【结论】克隆获得的MeERF5基因属于AP2/ERF类转录因子,参与木薯多种非生物胁迫应答过程。     

△''-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因在水稻上的荧光原位杂交

脯氨酸的积累与植物对干旱和盐胁迫的抗性有关.P5CS基因编码一个双功能酶,具有谷氨酸激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氨酶活性,催化脯氨酸合成过程中的前2步反应.它是脯氨酸合成的限制因子.用生物素标记的荧光原位杂交技术,以蛾豆(Vigna aconitifolia)中克隆到的P5CS基因作探针对水稻进行物理作图.该探针定位于水稻第9染色体的短臂近端点处,信号点距着丝粒的相对距离为(51.79±1.24)%.P5CS基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中.     

吡嘧磺隆·二甲四氯钠·氯氟吡氧乙酸异辛酯防除水稻田杂草的效果及对水肥和产量的影响

试验研究了55%吡嘧磺隆·二甲四氯钠·氯氟吡氧乙酸异辛酯WP防除水稻移栽田主要阔叶杂草和莎草科杂草的效果,以及对田间水肥的影响。结果表明,施用55%吡嘧磺隆·二甲四氯钠·氯氟吡氧乙酸异辛酯WP对移栽稻田空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)、异型莎草(Cyperus difformis)、鸭舌草(Monochoria vaginalis)的综合防效可达92.88%~99.71%,有效改善了田间的水肥条件,比CK未施药增产27.62%~33.31%,增产效果显著。     

棉花盐胁迫应答基因GhCPK5的克隆及序列分析

本研究克隆了1个陆地棉新的钙依赖蛋白激酶基因GhCPK5(Genbank登录号为:HM002634)。GhCPK5基因组DNA序列全长3 031 bp,包含一个1 707 bp的开放阅读框,具有7个外显子和6个内含子。GhCPK5可能定位于细胞核内,有568个氨基酸残基,分子量为63 ku。氨基酸序列分析表明,陆地棉GhCPK5与杨树PtCPK5同源性达到89%,同样包含完整的激酶结构域和4个EF-hand结构域。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎、叶等组织中表达;在盐胁迫处理下,GhCPK5在各组织的表达量明显上升。     

团花树木葡聚糖转葡糖苷酶cDNA克隆及序列分析

以团花树形成层组织中大量表达的RNA为材料,通过反转录、保守区域PCR、3′RACE和染色体步移等技术获得了团花树AcXET的全长cDNA序列,共1396bp。核苷酸序列分析表明:该序列含有1个960bp的开放阅读框,编码1个由320个氨基酸组成的蛋白质。该基因编码蛋白与已报道的其他植物的XET蛋白有较高的同源性,且含有XET的活性催化位点EIDFE。     

钙离子对盐胁迫小麦幼苗脯氨酸含量及其相关酶活性的影响

研究了Ca~(2+)对盐胁迫小麦幼苗脯氨酸含量及相关酶活性的影响.结果表明,脯氨酸含量在低盐胁迫下增加不明显.高盐胁迫下显著增加;可溶性糖含量及吡咯琳-5-羧酸还原酶(P5CR)活性与其变化趋势一致; 吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)活性在盐胁迫下变化不明显;脯氨酸脱氢酶(PDH)活性在高盐胁迫下显著增加;盐胁迫下K~+含量显著降低,Na~+含量明显增加.加入Ca~(2+)后,脯氧酸含量在低盐胁迫下变化不明显,高盐胁迫下显著降低,与可溶性糖含量和P5CR活性变化一致;Ca~(2+)对P5CS活性无明显影响,而使高盐胁迫下PDH活性显著增加;Ca~(2+)明显降低了盐胁迫下Na~+含量,提高了K~+含量及K~+/Na~+.这说明脯氨酸仅在高盐胁迫下显著积累,Ca~(2+)明显降低了高盐胁迫下的脯氨酸含量,这一效应主要与P5CR活性降低、PDH活性及K~+/Na~+增加有关.     

碱蓬SgP5CS基因过表达提高拟南芥耐旱性

脯氨酸是植物中的渗透调节物质,Δ¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是其合成过程中重要的调控因子。为探究P5CS基因功能,克隆了碱蓬SgP5CS基因并导入拟南芥,使其在拟南芥中过表达,然后进行相关指标测定和耐旱性鉴定。结果显示,干旱胁迫诱导2周后,SgP5CS过表达的拟南芥植株具有较长的根系,同时游离脯氨酸的含量显著增加,丙二醛含量显著降低,表明SgP5CS基因在拟南芥中过表达能够增强拟南芥耐旱性。研究结果为深入了解碱蓬中SgP5CS基因的功能及其在植物中的抗旱机制奠定了基础。     

木薯环指蛋白基因MeRFP8克隆及表达

采用RT-PCR方法,首次从木薯华南8号(SC8)克隆一个环指蛋白RFP基因家族成员MeRFP8.该基因c DNA包含1059 bp的开放阅读框,编码一个由352个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质分子质量为39.23 ku,理论等电点为4.84,C末端含有保守的结构域RING finger domain(Ring-H2 zinc finger),属于C3H2C3型环指蛋白.利用实时荧光定量PCR分析MeRFP8基因在木薯SC8及其同源四倍体叶片的表达水平,结果显示:5℃低温胁迫24 h内,SC8和其四倍体MeRFP8基因先下调表达,后上调表达,呈"V"字型.而且MeRFP8基因在SC8的表达变化水平比其同源四倍体大.推测MeRFP8基因可能参与木薯的低温响应.