基于BSA-seq的甜瓜抗枯萎病相关基因的定位与候选基因的注释

为挖掘甜瓜抗枯萎病相关基因,本研究以高抗枯萎病自交系YN为母本,高感枯萎病自交系CG为父本构建F₂群体,基于F₂群体分别构建极端高抗混池和高感混池,对子代混池和双亲池开展30×覆盖深度的全基因组重测序,通过计算2个子代池的SNP-index,比较SNP-index在高抗池与高感池染色体各区段的差异,定位与抗病性的关联区域,根据基因注释信息,预测候选基因。结果表明4个样本获得的SNP位点和InDel分别在91万～250万个之间和17万～45万个之间。基于SNP-index关联分析,在99%的置信区间内将候选区域定位到甜瓜染色体Chr.9的1个区间,总长度为1.37 Mb,位于1～1 370 000 bp区间,包含197个基因,SNP-inDel位点数7 442个。通过对候选区域内的基因进行KEGG、GO数据库分析发现,候选基因分别被注释到18个生物学进程、9个细胞组分和6个分子功能中;主要参与氨基酸生物合成、氨基酸代谢、酯类代谢、糖类代谢等,经分析在候选区域内与抗病性相关的基因共有22个,3个与F-box基因相关,3个水解蛋白相关基因,4个乙烯...     

基于SLAF-seq及BSA技术的甜瓜抗蔓枯病QTL定位分析

为研究甜瓜蔓枯病(GSB)抗病基因在甜瓜染色体上的定位情况,对甜瓜蔓枯病抗病亲本P181、感病亲本P01及其F_2遗传分离群体进行蔓枯病抗性鉴定,根据F_2蔓枯病发病情况,选择2个亲本及F_2中极端抗病和极端感病的子代各30个,提取DNA并分别构建抗病和感病基因混池,利用SLAF-seq和BSA技术进行蔓枯病抗病基因QTL定位分析。测序共开发得到188 022个SLAF标签,分析过滤掉低质量的SNP位点后,获得5 676个高质量的SNP标记。采用SNP-index关联分析方法,在甜瓜染色体上获得2个与GSB抗性紧密关联的候选区域,一个定位于Chr01上的9 837 447～11 028 838 bp区间,区间大小为1.19 Mb;另一个定位于Chr04上的33 135 224～33 993 540 bp区间,区间大小为0.86 Mb。共有218个基因定位在关联区域内,依据基因功能注释分析,推测可能与甜瓜蔓枯病抗病相关的候选基因有15个,包括NBS-LRR基因1个,E3泛素蛋白连接酶合成基因5个,RPM1相关蛋白基因1个,锌指蛋白相关基因1个,NAC结构域蛋白基因1个,钙依赖蛋白激酶2个,凝集素相关受体蛋白基因3个,RING-H2 finger蛋白基因1个。研究结果将为甜瓜蔓枯病的抗性基因研究提供参考。     

利用生物信息学和qRT-PCR分析鉴定水稻细菌性条斑病QTL qBlsr5a的候选基因

细菌性条斑病(简称细条病)是水稻的主要病害之一。前期研究已将细条病抗性QTL qBlsr5a精细定位在5号染色体上一个大约300kb的区间内。为了寻找该QTL的候选基因,本研究利用生物信息学方法对该区间进行分析,筛选出10个与抗病相关的注释基因。然后以感病品种H359及其抗病近等基因系H359-BLSR5A为材料,对细条病菌接种后这10个基因的表达动态进行qRT-PCR分析。结果表明,2个基因在抗、感材料中几乎没有检测到表达产物;7个基因对病原菌侵染没有明显的响应;1个基因(LOC_Os05g-01700)在病原菌侵染后表达量发生变化且在抗、感材料间存在显著差异。因此推测,该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。     

基于BSA-Seq和RNA-Seq方法鉴定大豆抗豆卷叶螟候选基因

豆卷叶螟(Lamprosema indicata Fabricius)是重要的大豆食叶性害虫,挖掘大豆抗豆卷叶螟相关基因对大豆抗虫品种选育和遗传改良至关重要。本研究用大豆高抗豆卷叶螟材料赶泰-2-2和高感豆卷叶螟材料皖82-178进行杂交构建F2代分离群体,从303个F2代单株中挑选出高抗豆卷叶螟和高感豆卷叶螟的单株各30株,分别构建2个极端性状的DNA混合池用于全基因组重测序以分析控制豆卷叶螟相关的候选基因。结果表明, 4个样本中共有11,963,077个单核苷酸多态性(SNPs)标记,根据SNP-index方法关联分析,共有329个基因位于99%置信区间外,这些基因主要集中在7号染色体5,601,065～5,865,237bp区间(总长为0.26Mb)、16号染色体2,975,110～6,336,096bp区间(总长为3.36Mb)、18号染色体44,366,115～54,297,600bp区间(总长为9.93Mb)等区域内。将BSA-Seq结果与转录组测序结果进行联合分析发现,有12个基因相关联;最后,结合生物信息学分析、候选基因的表达模式和基因的同源注释,锁定CNGC4、WRKY16转录因子、AAP7、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、ZPR1B等12个基因为控制豆卷叶螟性状相关的候选基因。本研究结果不仅为解析大豆抗豆卷叶螟的分子机理奠定重要的基础,也将为大豆抗虫基因的克隆奠定坚实的理论基础。     

利用SNP芯片和BSA分析规模化定位小麦抗白粉病基因

规模化定位小麦品种携带的抗白粉病基因对于抗病性种质创新和新品种选育具有重要的意义。本研究采用Illumina Infinium iSelect 90k SNP芯片结合集群分离分析法(bulked segregate analysis,BSA)对36个河南省小麦新品系携带的抗白粉病基因进行了定位。SNP芯片检测表明,在24个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到一个明显富集的SNP峰,表明其可能携带单一主效抗白粉病基因;在其他12个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到多个SNP峰,推测其可能含多个抗白粉病基因。有26个小麦品系在2AL染色体上检测到的SNP数目最多,推测其携带位于2AL染色体上的Pm4b抗白粉病基因。开发出与2AL染色体上抗白粉病基因紧密连锁的分子标记Xwggc116,可用于这些小麦品系中抗白粉病基因的分子检测。研究结果表明高通量SNP分析技术平台可以用来规模化定位小麦品种中的抗白粉病基因,明确了河南省抗白粉病小麦品系中携带Pm2、Pm4b、Pm21和新1BL/1RS易位等有限的抗白粉病基因,抗病基因资源非常狭窄,亟需引进新的多样化抗病基因资源,拓宽遗传基础,培育抗病小麦新品种。     

小麦种质N9659抗白粉病基因SSR标记研究

采用SSR技术对含有野生二粒小麦AS846抗白粉病基因的N9659进行了分子标记研究。用高感小麦白粉病的普通小麦品种陕160与N9659杂交,F1表现高抗,F2苗期抗病和感病植株的分离比例符合3∶1,表明N9659苗期白粉病抗性由1对完全显性基因控制;采用208对小麦SSR引物对"陕160×N9659"F2抗感池分析,筛选出3个在抗感池间存在多态性引物WMS67,WMS408和WMS604;经分离群体验证,该抗病基因与小麦染色体5B上的微卫星位点Xgwm67,Xgwm408和Xgwm604连锁,遗传距离分别为6.7,9.0和17.3 cM,该抗病基因可能来源于母本即野生二粒AS846,此基因不同于已有抗白粉病基因,可能为新基因。     

大白菜叶柄黑点症抗性相关候选基因的挖掘

大白菜叶柄黑点症是严重影响大白菜商品性的一种生理性病害。本研究以抗大白菜叶柄黑点症品系(韩春娃C8-1)和感叶柄黑点症品系(韩春娃-4-2-3-4)为亲本,构建F2群体,通过高N水平水培处理,筛选出高抗叶柄黑点症和高感叶柄黑点症的植株各20株,构建两个极端性状混池DNA文库,通过BSA-Seq技术,对大白菜叶柄黑点症抗性相关候选基因进行挖掘。对于502 662个高质量的SNP位点和173 111个高质量的In Del位点,利用ED和Index方法对这些SNP和InDel位点分别进行关联分析,取所有结果的交集,得到1个包含295个编码基因,位于第1染色体的候选区域,与叶柄黑点数性状紧密关联;对这295个基因进行进一步的功能注释,NR、Swiss-Prot、GO、KEGG和COG数据库共注释到292个基因,其中存在133个非同义突变基因,30个移码突变的基因。候选区域内编码基因的深度注释有助于功能基因的进一步分离,为大白菜叶柄黑点症抗性相关基因的精细定位及克隆提供理论依据。     

小麦新种质N9628-2抗白粉病基因的SSR分析

以抗白粉病的波斯小麦-小伞山羊草双二倍体Am9为母本, 与高感白粉病的普通小麦品种陕160杂交, 并用陕160回交一次, 从其后代中选育的普通小麦种质N9628-2对陕西省关中地区白粉病流行小种关中4号表现免疫。为了明确N9628-2所携带抗性基因的遗传方式及与抗性基因连锁的分子标记, 对该种质的抗白粉病基因进行了遗传分析和SSR标记分析。用高感白粉病品种陕160、陕优225与N9628-2杂交, F₁代对白粉病均表现高抗, F2代抗感分离比例均符合3∶1, 表明N9628-2的白粉病抗性由1对显性基因控制。通过208对SSR引物对陕160 ´ N9628-2 F2代抗感分离群体的142个单株的检测, 发现位于6A上的SSR位点Xwmc553和Xwmc684在双亲和抗、感池间有特异性, 并与抗性基因连锁, 遗传距离分别是10.99和7.43 cM, 表明抗病基因可能位于6A染色体上。 用中国春部分第6同源群的缺体-四体系和双端体系进行验证, 进一步将抗性基因定位在6AS。用连锁的SSR标记和相关亲本分析表明, 该抗病基因可能来源于小伞山羊草Y39, 它不同于已有抗白粉病基因, 可能是一个新基因。     

源于长穗偃麦草的小麦新品系CH7034抗白粉病基因的染色体定位

CH7034是一个兼抗小麦白粉病和条锈病的新种质材料,通过普通小麦与八倍体小偃麦"小偃7430"杂交、回交选育而成.为明确其白粉病抗性的遗传机制及抗性基因的染色体位置,用小麦高感品系"SY95-71"与CH7034杂交,所获F1、F2及其双亲在温室用白粉病E09菌系的15号小种接种,对CH7034的白粉病抗性进行鉴定和遗传分析.结果表明,无论是苗期还是成株期,CH7034对白粉病菌均表现为免疫,且具有与其抗性供体小偃7430及野生亲本长穗偃麦草相似的白粉病抗性,F1代抗病反应型为O或O'级,F2代抗感分离比符合R:S=3:1,说明CH7034抗性受显性单基因控制.用307对小麦微卫星引物对一个148株的F2群体进行分析,发现小麦微卫星标记xgwm311与抗病基因连锁,遗传距离为12.4 cM.用中国春缺-四体和双端体材料进一步验证与抗病相关的片段位于2A染色体的长臂上,进而将CH7034所含的抗白粉病基因定位于小麦的2AL上.     

小麦品种“唐麦4号”抗白粉病基因的分子标记与染色体定位

唐麦4号是对小麦白粉病(Blumeria graminis f. sp. tritici)具有良好抗性的T1BL·1RS育成品种, 遗传分析结果表明, 唐麦4号携带1个抗白粉病半显性单基因, 暂命名为PmTm4。采用唐麦4号为抗病亲本的杂交组合(唐麦4号/Clement)F2代抗、感病分离群体和F3代家系, 利用集群分离分析法(BSA)建立了与PmTm4连锁的分子标记连锁图Xcau12—Xgwm611—PmTm4—XEST92—Xbarc1073—Xbarc82—Xwmc276。根据小麦7BL连锁图的标记顺序和抗白粉病基因连锁标记在中国春缺体-四体、双端体和缺失系上的定位结果, 将PmTm4基因定位于小麦7BL染色体臂末端。以上研究结果为唐麦4号抗白粉病基因在育种中的利用、分子标记辅助选择和基因累加提供了便利。     

小麦新品种济麦22抗白粉病基因的分子标记定位

为明确济麦22携带抗白粉病基因的染色体位置,利用济麦22与感病亲本中国春杂交,用小麦白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)强毒性小种E20对F₂抗、感分离群体和F_2:3家系进行抗病鉴定和遗传分析。结果表明,济麦22携带1个显性抗白粉病基因, 暂被命名为PmJM22。运用SSR和EST标记及分离群体分组分析法(bulked segregant analysis, BSA),将其定位在2BL染色体上,与4个SSR和5个EST标记间的连锁距离为7.7 cM (Xwmc149)到31.3 cM (Xbarc101)。通过分析2BL上其他抗白粉病基因的来源、染色体位置和抗性反应,认为PmJM22不同于Pm6、Pm26、Pm33和MlZec1。     

利用BSA-seq发掘棉花适宜机采的果枝长度相关QTL

【目的】将群体分离分析法与下一代测序技术相结合,定位与棉花果枝长度关联的数量性状位点。【方法】以Ⅰ式果枝品系苏机棉125和Ⅱ式果枝品种泗抗1号为亲本,构建棉花F2分离群体。根据F2群体单株中部果枝节间平均长度,选择极端性状单株分为2组,构建DNA混池。再对2个混池进行重测序,分析2个混池之间的单核苷酸多态性和插入缺失突变,并利用欧式距离法关联与果枝节间长度相关的数量性状位点。【结果】利用测序获得的单核苷酸多态性位点数据,在A3染色体上定位到1个与果枝节间长度关联的区域,区间范围为0.8Mbp;利用测序获得的缺失突变位点数据,也在A3染色体上定位到1个关联区域,区间范围为1.09Mbp;2个关联区域互相重合,重合区间为0.77Mbp。【结论】本研究中Ⅰ式果枝相关基因被定位在A3染色体上,说明棉花Ⅰ式果枝和〇式果枝的差异是因为遗传位点和模式的不同,而不是同一基因的剂量效应。     

大豆细菌性斑点病抗性评价及QTL定位

为了筛选获得稳定抗细菌性斑点病种质和挖掘有效抗病基因,本研究以野生型大豆ZYD00006与‘绥农14’构建的全基因组回交导入系群体为试验材料,利用高压喷雾法接种丁香假单胞杆菌Psgneau001进行细菌性斑点病抗病性鉴定。运用复合区间作图法(composite interval mapping,CIM)进行细菌性斑点病QTL定位,并针对定位区间进行基因功能注释和相关抗病基因的筛选和预测。结果表明:QTL分析共检测到6个位点与抗病相关(qbsd-D1a-1,qbsd-A1-1,qbsd-C2-1,qbsd-A2-1,qbsd-D2-1,qbsd-D2-2);分别位于1号(LG D1a)、5号(LG A1)、6号(LG C2)、8号(LG A2)、17号(LG D2)染色体上。经基因注释和筛选共获得41个候选基因,它们多与富含亮氨酸重复序列受体蛋白(LRR protein)相关。本研究通过QTL初定位明确了大豆细菌性斑点病相关区间,为进一步精细定位和分子标记辅助育种提供科学依据。     

基于BSA-seq技术挖掘芝麻株高相关候选基因

为了进一步挖掘芝麻株高相关基因,为适机收芝麻新品种选育提供理论指导,以冀航芝1号和DW607为亲本构建F2群体,并构建以株高为目标性状的极端混池,利用BSA-seq技术,采用ED和Δ(SNP-index或InDel-index)2种方法挖掘株高相关的染色体区段,注释区段内的基因信息,利用GO和KEGG等数据库分析注释基因的功能.结果发现,亲本之间共获得298634个SNP和76360个InDel,混池之间共获得24048个SNP和9630个InDel;基于SNP标记的ED方法关联到5个染色体区段,ΔSNP-index方法关联到3个染色体区段,两者的交集有3个;基于InDel标记的ED方法关联到5个染色体区段,ΔInDel-index方法关联到8个染色体区段,两者的交集有8个;4个染色体区段同时被SNP和InDel标记关联到,共注释到330个基因,比对到的前20个KEGG通路主要包括植物激素信号转导和能量代谢;GO富集结果表明,有18个基因参与生长素响应,可能是参与株高调控的关键基因.     

小麦抗白粉病基因Pm5e的SSR标记研究

小麦白粉病是由小麦白粉菌（Erysiphe gramini f.sp．fritici）引起的真菌性病害。冬小麦品种复壮30中含有一个单隐性抗白粉病基因,即Pm5e。该基因对我国流行的白粉病小种表现为高抗或免疫。本研究以含抗白粉病基因的复壮30、感病品种Chancellor为材料构建F2分离群体,利用分离群体分组分析法（bulked segregant analysis,BSA）对该抗白粉病基因进行了SSR标记分析。在已定位在7B染色体上的56对SSR引物中,8对引物能在亲本间稳定的揭示多态性差异,3个引物Xwmc364、Xbarc065和Xwmc517在抗、感亲本,抗、感池间均表现多态性差异,F2分离群体的验证结果表明标记Xwmc364175、Xbarc06590和Xwmc517200与抗病基因连锁,遗传距离分别为4．9cM、5．1cM和18．5cM。其中标记Xwmc364175和Xbarc06590与抗病基因连锁紧密,在对Pm5e的标记辅助选择（marker-assisted selection,MAS）中具有重要利用价值。     

水稻抗稻瘟病基因Pi47的精细定位和候选基因分析

不断挖掘和克隆抗稻瘟病新基因, 是解析水稻抗病分子遗传机制和培育抗稻瘟病新品种的重要基础。Pi47是笔者从广谱、持久抗稻瘟病湖南地方品种湘资3150中鉴定的稻瘟病抗性基因, 前期研究将其初步定位于第11染色体标记RM224和RM5926间。本研究利用3个Pi47单基因系与感病亲本CO39杂交F₂群体1687个感病单株对Pi47精细定位, 利用6个STS标记对3个单基因系进行背景分析, 采用生物信息学方法进行了候选基因分析。结果表明, Pi47被精细定位于CAPS标记S32与K33间0.24 cM区域的171.2 kb物理区间内, 背景分析将Pi47进一步缩小至SC12和K33间67.8 kb的区间内; 该区间含有8个结构基因, 其中2个编码NBS-LRR抗病类似蛋白, 为Pi47的候选功能基因。稻瘟菌抗谱比较分析发现, Pi47单基因系与其定位区间内4个Pik位点的等位基因Pik、Pikm、Pikh和Pikp的近等基因系抗谱不同。这些结果为进一步克隆Pi47和利用其进行分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品种奠定了基础。     

甘蔗抗褐锈病新基因抗感病池构建及SSR多态性引物筛选

由黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H. Sydow ＆ P. Sydow)引起的甘蔗褐锈病是危害中国甘蔗生产的主要病害之一。为了鉴定和发掘抗褐锈病新基因,防止褐锈病爆发流行和保证甘蔗安全生产,本研究以杂交组合‘粤糖03-393’× ‘ROC 24’抗感分离真实性F₁代群体为材料,构建抗感基因池,合成449对引物对抗感亲本及抗感基因池进行抗、感连锁SSR分子标记筛选。结果表明,25对引物在抗感亲本间有多态性,其中4对引物(SMC236CG、SCESSR0928、SCESSR0636、SCESSR2551)在抗感亲本及抗感池间有多态性,初步判定这4个SSR标记在染色体上的位点可能与抗褐锈病新基因存在连锁关系。研究结果为后续开展抗褐锈病新基因定位、为中国甘蔗褐锈病防控及抗病育种奠定了良好的基础。     

小麦遗传资源抗白粉病基因的STS标记检测

从小麦中筛选抗白粉病基因,为小麦抗病育种提供抗病亲本,为育种后代抗病基因鉴定提供理论依据和技术支撑。以河北省保存的65份小麦遗传资源为材料,利用STS标记技术,对其所携带的抗白粉病基因进行检测。结果表明:检测出携带Pm21、Pm4a和csLV34抗白粉病基因的品种各一个,分别为金禾7178、河农7069和秋麦。这些资源可以作为抗病亲本在小麦抗白粉病育种中利用。     

利用SLAF-seq结合BSA方法发掘大豆种皮色相关基因

种皮色不仅是一个形态标记,还是一种重要的进化性状,与大豆商品性、营养价值以及抗性关系密切。本研究以黄色种皮大豆品系BMY及其褐色种皮衍生品系BMZ为亲本,从F2群体中分别挑选出黄色种皮和褐色种皮的植株各9株,构建了两个极端性状混合池DNA文库,借助SLAF-seq和BSA技术,挖掘大豆种皮色性状相关候选基因。对于26121个高质量SNP位点,利用SNP-index方法和ED方法进行综合分析,获得8个与目标性状紧密关联的候选区域,分别位于第5、11、12、19和20染色体,包含620个编码基因。对这620个基因进行进一步的功能注释,NR、Swiss-Prot、GO、KEGG和COG数据库分别注释到600、518、533、133和256个基因,其中存在非同义突变基因4个,分别为Glyma05g005600、Glyma05g009700、Glyma12g006100和Glyma12g047300。候选区域内编码基因的深度注释有助于功能基因的进一步分离,为大豆种皮色性状相关基因的精细定位及克隆提供理论依据。     

与黄瓜白粉病抗病基因紧密连锁的SSR分子标记

黄瓜白粉病是影响黄瓜生产的主要病害,为建立黄瓜抗白粉病分子标记辅助选择体系,我们以黄瓜抗白粉病亲本WIS2757和感白粉病亲本19032以及它们的F2群体为试材,采用SSR分析技术,对相关抗性基因的连锁分子标记进行了研究。获得了2个与黄瓜白粉病主效抗病基因连锁的SSR分子标记SSR97-200,SSR273-300,连锁距离分别为5,13cM,这些SSR标记可以作为黄瓜抗白粉病辅助选择的分子标记。