猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)SA毒株的分离与鉴定

从仔猪内脏分离到一株猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株，该毒株能在Marc－145细胞上增殖致细胞病变，该病变能被PRRSV美洲型阳性血清所抑制，不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制，经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察到直径55nm左右的病毒粒子，属RNA病毒，接种阴性仔猪未见临床症状异常，但血清学阳性。命名该分离毒为PRRSV－SA毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒新疆株的分离与鉴定

为了解猪繁殖与呼吸道综合征在新疆的流行现状,以及病毒毒株的分子生物学特征,对疑似该病病料进行地方毒株的分离,并对其进行鉴定。采集新疆乌鲁木齐市七道湾某猪场疑似PRRS病死的猪只肺脏及淋巴结等组织病料,将其处理后接种到Marc-145细胞上,并盲传3代;对分离株进行毒力测定(TCID50),应用RT-PCR方法对出现CPE的细胞培养物进行分子检测。结果显示,分离到的新疆病毒株可发生细胞病变,在Marc-145细胞上的TCID50为10-5·mL-1。RT-PCR检测结果用琼脂糖凝胶电泳鉴定基因序列,将测序结果与GenBank已发表的PRRSV毒株基因序列进行对比分析。研究证明所分离到的病毒为PRRSV,命名为XJ-Q。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒XINX株的分离及NSP2基因的遗传进化分析

为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒在河南地区猪体内的进化情况,笔者采集了河南新乡地区出现的疑似猪繁殖与呼吸综合征的流产猪胎,并进行了病毒的分离鉴定,同时对分离病毒株的NSP2基因部分序列进行遗传进化分析。结果共分离并鉴定出1株美洲型猪繁殖与呼吸病毒XINX,且NSP2基因部分序列的分析显示,该毒株与以往的分离毒株不同,其NSP2基因存在393 bp的不连续缺失,同国内之前报道的经典毒株和高致病性毒株间均存在较大差异,目前在国内尚数首次出现。研究结果为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子进化提供了重要信息。     

犬细小病毒CPV-JZ2021株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒的生物学特性和遗传进化情况,从湖北馨爱宠物医院有限公司收集疑似病犬的粪便,无菌处理病料后接种猫肾细胞(CRFK)进行病毒的培养,至出现明显的细胞病变.通过PCR扩增、电镜形态学观察、间接免疫荧光检测、血凝试验等进行病毒鉴定,结果表明,成功分离出一株犬细小病毒,并命名为CPV-JZ2021.该病毒的血凝效...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒宁夏地区地方株的分离与鉴定

[目的]弄清宁夏地区部分猪场出现“无名高热”病因及更加有效预防、控制此类疾病的发生.[方法]通过从宁夏某发病猪场采集产生典型病变的猪肺部组织,将病料处理后分别用Marc-145、PK-15、BHK-21等传代细胞系进行病毒的分离与鉴定.[结果]只有Marc-145细胞上有典型病变,连续传代3次后病变稳定,接毒48 ～72 h后病变率达70％左右.RT-PCR及双酶切的结果表明分离培养物为猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株.通过RNA提取、RT-PCR及酶切反应,实现了对分离培养物快速、确切鉴定.[结论]用MARC-145细胞成功分离到1株PRRSV,命名为ZH-w株.     

4株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离和鉴定

为了进一步分析本次猪暴发高发病率和高死亡率疫情的病因,本研究利用病毒分离与鉴定方法,将4份RT-PCR鉴定为单纯PRRSV阳性的组织病料,接种Marc-145细胞,经RT-PCR、IFA和电镜鉴定成功的分离到4株PRRSV,TCID50为10-6.5/0.1ml,命名为BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株.本研究建立的方法为PRRS的诊断及防制提供了技术保障.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5基因的遗传变异与系统进化分析

为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在国内的分子遗传进化情况,对中国大陆1996～2008年间33株PRRSV分离毒株(29株来自GenBank)的GP5序列与国外部分代表毒株进行了分析比较.结果表明,所选PRRSV中国分离毒株中有32株属于北美洲型(NA),并大致可分为2个基因亚群,1株属于欧洲型(EU).其中,自2006年在我国暴发的高致病性蓝耳病病毒(H-PRRsV)属于亚群1,且与YA株亲缘关系较近;亚群2毒株则与Ingelvac的弱毒疫苗株及其亲本株VR-2332具有较高的同源性.     

四川省猪流行性腹泻病毒SNJ-P株的分离鉴定与遗传进化分析

【目的】探究四川省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株流行变异情况,并分析疫苗免疫效果不佳的原因。【方法】从四川某猪场采集仔猪肠道样本进行PCR检测、病毒纯化、病毒滴度测定以及病毒感染等试验;测定分离株全基因组序列,将分离株S基因序列与其他地区毒株及疫苗株进行比对并构建进化树;比较分离株与经典疫苗株CV777 S蛋白氨基酸位点变异情况。【结果】成功分离获得1株PEDV毒株,并命名为PEDV SNJ-P,该毒株病毒滴度为1×107.5/100μL。动物感染试验表明：分离株能引起仔猪出现腹泻和脱水等症状并导致死亡。全基因组测序及遗传进化分析表明：PEDV SNJ-P株全基因共28 003 bp,基因型为S non-INDEL型;与同型的中国分离株PEDV-WS、CH/JLDH/2016和CH/HNLH/2015等毒株亲缘关系较近,与同型的疫苗株亲缘关系相对较远,与经典疫苗株亲缘关系较远。与经典疫苗株CV777相比,SNJ-P株的S蛋白存在多处氨基酸突变、缺失和插入现象。【结论】由于毒株出现变异,SNJ-P株与疫苗株亲缘关系较远,当前所用疫苗无法提供有效保护。本研究结果以期为国内PEDV毒株的研...     

4株高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离与鉴定

2007年7月从江苏某些猪场采集的具有明显高热症状的病料组织中分离出4株病毒,经对病毒的TCID50测定、血清学试验、病毒基因鉴定,确认这4株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒.病毒基因序列分析发现:4株病毒的NSP2基因均存在2处共30个氨基酸缺失,缺失氨基酸分别位于481位、532～560位.氨基酸序列同源性分析可见:分离株与VR2332株、MLV株的同源性很低,在60.3%至68.6%之间;与国内疫苗株CH-1a的同源性为83.1%～83.7%;与国内分离的变异株JXAI株、HUN4株、HB-1(sh)/2002株同源性很高,为91.2%～98.5%;同时4株分离株之间的同源性很高,为99.3%～100.0%.系统发育树表明:分离的4个毒株与JXAI毒株和HUN4株有较近的亲缘关系,与其他株的亲缘关系较远.动物回归试验表明,4株病毒均可以引起仔猪明显的临床高热症状.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒17-ZJ-HZ毒株的分离鉴定与分子流行病学分析

杭州某猪场断奶仔猪群出现高热、呼吸困难等症状,疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染,3头病猪肺脏病变样本送本实验室检测,通过RT-PCR方法检测其病原核酸。肺脏匀浆液无菌处理接种到MARC-145细胞,细胞病变观察、Western-blot、间接免疫荧光等方法验证PRRSV病毒分离情况;RT-PCR方法分五段扩增获得全长病毒基因组序列,采用MEGA等软件分析该毒株的核苷酸序列以及GP5、NSP2氨基酸序列;分离病毒接种3日龄PRRSV阴性仔猪,评价该病毒的毒力。结果表明:该场送检样品为PRRSV阳性;成功分离得到17-ZJ-HZ病毒;获得15 325 bp的 PRRSV全基因组序列。序列分析表明,该毒株与经典北美株的NSP2存在典型的29+1个氨基酸的缺失,且进化分析归于HP-PRRSV亚群。攻毒60 h后猪只出现典型的PRRSV临床症状和病理变化,以上结果表明该毒株为高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)的北美株。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病株的分离与鉴定

[目的]分离一株近期流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒并解析其基因变异情况.[方法]适当处理猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性临床样品,接种非洲绿猴胚胎肾细胞进行病毒分离,间接免疫荧光试验对所分离病毒进行鉴定;同时用RT-PCR技术扩增其全基因组,并进行序列测定与分析.[结果]分离培养物可引起非洲绿猴胚胎肾细胞出现稳定的细胞病变,间接免疫荧光试验显示有许多特异性荧光,分离培养物中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒.病毒全基因组大小15 323个核苷酸,在非结构蛋白2基因有30个氨基酸缺失的典型标记;其与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株JXA1株、HUN4株和SD-CXA/2008株之间的核苷酸同源性较高,达到98.9％以上;该毒株与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SD-CXA/2008株在同一分支上.[结论]分离出一株典型的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析

用间接免疫荧光试验和RT-PCR方法,从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定、比较分析和绘制进化树.结果表明,16株分离株之间的氨基酸序列同源性为88.1%～99.8%;与欧洲型LV株和美洲型VR-2332株的氨基酸序列同源性分别为54.0%～54.5%和88.1%～99.2%,证明分离的16株病毒均为美洲型.用DNAstar等软件对16株分离株推导的氨基酸序列作进一步比较分析,发现16株分离株ORF5基因编码的gp5蛋白的抗原区、潜在疏水区、跨膜区和N-糖基化位点分布均有差异,与其它美洲型毒株也存在一定程度的差异,说明在河南流行的PRRSV存在明显的遗传差异性.     

变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒FJ06A毒株的分离鉴定和致病性

从某一疑似发生无名“高热病”猪场的病料中分离到一株病毒,经病毒RT-PCR鉴定、生物学特性分析、病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP2基因序列分析及对不同日龄猪感染试验的结果表明:分离毒株为变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),该病毒具有高致病性,病毒能在Marc-145细胞上增殖并产生病变,其结构蛋白ORF2-ORF...     

猪瘟病毒IPMA检测方法的建立

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t建立一种可直观判断猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的检测方法。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t应用PRRSV多抗血清作为一抗,建立了PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测体系,并对相关反应条件进行优化,对其特异性和敏感性进行检测。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t最佳病毒接种感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,最佳感染时间为24 h,一抗最佳稀释度为1∶1 000,所建立的PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测方法与其他几种流行猪病无交叉反应。对300份来自不同地区的临床血清进行检测,IPMA与PCR检测阳性符合率达93%。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t该方法具有良好的特异性和敏感性,为PRRSV的临床检测提供新方法。\t\t\t\t     

猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒的分离与初步鉴定

从患败血症仔猪的肺脏、淋巴结组织中分离到1株猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV);流行特征表现为仔猪出现严重的呼吸道症状;该病毒能在Marc-145细胞上生长,但不能在Vero、BHK21、RK等细胞上增殖;分离毒适应Marc-145细胞后,产生以皱缩、脱落、崩解为特征的细胞病变,分离毒Marc-145第4代的TCID50为10-6.725*0.1ml-1;ELISA抗体检测表明,病猪和分离毒接种仔猪体内含有PRRSV IgG、IgM抗体.     

猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其gE、TK 全基因序列遗传变异分析

将分离到的8种PRV分离株的g E、TK基因与国内外的毒株进行核苷酸及氨基酸的序列同源性分析,结果发现,分离毒株的gE、TK基因与15株国内外已发表的代表毒株核苷酸及氨基酸的序列同源性分别为97.3%~99.9%、98.7%~99.9%;遗传进化分析结果表明,分离毒株与国内近年分离自不同省份的代表毒株亲缘关系较近,与国外分离的代表毒株亲缘关系较远;而对gE、TK基因氨基酸主要变异位点分析表明,gE和TK基因都有一些位点已经发生突变。结果表明猪PRV广东部分地区分离毒株已发生变异,为规模化猪场对猪伪狂犬病的净化以及疫苗的选择提供参考。     

1株猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的遗传演化分析

将2008年云南某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征病例的病料处理后,接种Marc-145细胞,并对其进行病毒分离和鉴定,将分离株命名为Yunnan-08株.根据GenBank中PRRSV的基因序列进行设计.合成了针对ORF5和ORF7基因的引物,将RT-PCR扩增目的基因克隆入pGEM-Teasy载体中进行测序,再将测序结果提交给GenBank.应用DNAstar软件包分析,将该毒株的ORF5和ORF7基因序列及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株Lv、美洲型代表株VR2332和中国参考株CH-1a(AY032626)等毒株相应基因序列进行核苷酸比对,并与ATCC-VR2332(U87392)株、Lv(M96262)株等毒株进行氨基酸同源性比较,绘制系统的进化树,确定遗传演化关系.结果表明,该分离株的ORF7与VR2332的ORF7基因同源性为56.9%,与Lv株的ORF7基因同源性为41.7%;该分离株的ORF5与VR2332的ORF5基因同源性为87.1%,与Lv株的ORF5基因同源性为63.8%.表明新分离到的PRRSV Yunnan-08株仍属北美型,但存在很大变异,该分离株的ORF5与中国标准株CH-1a的ORF5基因同源性为93.4%,而ORF7与中国标准株CH-1a的ORF7基因同源性仅为56.6%.同一个毒株不同的开放阅读框架遗传演化的差异如此之大,这在以往未见报道,该病毒的变异为我国对该病的防控设置了障碍,毒株遗传监测显得十分重要.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

1株NSP2蛋白5个氨基酸缺失的PRRSV遗传进化分析

【目的】研究新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况。【方法】提取PRRSV感染病猪肺脏RNA,通过RT-PCR方法对PRRSV NSP2部分基因和ORF5基因进行扩增、克隆和测序,分析其分子变异特征。【结果】成功克隆到1株PRRSV,命名为XJzx1株,其NSP2基因编码蛋白第472~476位存在5个氨基酸的连续缺失,有别于高致病毒株第482、533~561位30个氨基酸的典型缺失,位于经典毒株HB-2(sh)/2002第471~482位12个氨基酸缺失区域内;XJzx1与HK13株NSP2部分基因核苷酸序列相似性最高,为87.5%,系统进化树分析显示,XJzx1株与我国高致病毒株JXA1、HUN4、SX2009等同属一个分支;XJzx1 ORF5基因与我国经典毒株CH-1a、BJ-4、HK6等同属一个分支,其GP5蛋白不存在氨基酸的缺失或插入,而表现为多位点的突变。【结论】PRRSV XJzx1株具有独特的遗传进化特征,其毒性较经典毒株有所加强,推测为新型变异株。