大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测试剂盒的研制

为了研制一种快速、准确诊断大肠杆菌O157:H7的PCR方法,试验根据GenBank收录的大肠杆菌O157:H7全基因组序列,设计并合成了2对可扩增rfbE(O157)和Flic(H7)基因片段的特异性引物,建立双重PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明:该检测试剂盒对大肠杆菌O157:H7能特异性地扩增出rfbE和Flic基因的目的片段;对大肠杆菌O157:H30、O157:H9、O157:H25、O157:H19只能扩增出rfbE而不能扩增出Flic基因的目的片段;对大肠杆菌DH5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段;细菌DNA的最低检测极限是50 pg;在-20℃条件下保存1,3,6,9,12个月后,其敏感性都没有发生改变,均能检测到50 pg的大肠杆菌O157:H7DNA模板。     

大肠杆菌O157:H7的疫病生态学研究进展及其控制对策

大肠杆菌O157:H7是一种感染剂量低,致病性强,临床上无特效治疗药物的新型肠道致病菌,在世界范围内多次爆发流行,已构成严重的公共卫生问题。对大肠杆菌O157:H7的基本生物学特征,从非生物因素(包括传染源、气候等因素)和生物因素两个方面综述了影响大肠杆菌O157:H7传播的环境因子,最后从病原菌的监测诊断技术、废弃物堆肥处理、加强食品以及饮水安全管理等方面提出了控制大肠杆菌O157:H7的对策,最终为大肠杆菌O157:H7的疫病生态学研究提供了理论基础和参考依据。     

西宁市售动物性食品中肠出血型大肠杆菌O157：H7的检测

对西宁市售的动物性食品羊肉(20份)、牛肉(20份)、猪肉(20份)、鸡肉(20份)、牛奶(20份)、卤肉(10份)进行了大肠杆菌O157:H7检验,各样品先用mEC肉汤增菌,然后在选择性培养基TC-SMAC、MUG-LST培养此菌,经微量生化实验初步鉴定。结果是从110份样品中分离出1株大肠杆菌O157:H7,总检出率为0.9%;说明在西宁市售动物性食品中检出了大肠杆菌O157:H7。     

大肠杆菌O157:H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157:H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157:H7快速定量检测的实时定量PCR方法.该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍.方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157:H7,对非大肠杆菌O157:H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应.利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157:H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌.为建立一种特异、灵敏的O157:H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157:H7活菌EMA-PCR检测方法.结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL.经EMA处理,从含有1％～100％O157:H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段.因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157:H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高.O157:H7 EMA-PCR技术的建立为O157:H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景.     

饲料中肠出血性大肠杆菌O157∶H7双重PCR检测方法的建立

根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌EMA-PCR检测方法。结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经EMA处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。O157∶H7 EMA-PCR技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。     

检测牛奶中肠出血性大肠杆菌O157:H7的双抗夹心化学酶联免疫方法的建立

为了检测牛奶中肠出血性大肠杆菌(enterohemrrhagic Escherichia coil, EHEC)O157:H7污染,采用兔多抗作为捕捉抗体与一株O157:H7单克隆抗体作为检测抗体进行配对,构建了针对EHEC O157:H7的双抗夹心化学发光酶联免疫检测方法。该方法最低检测限可达到2.5×10~4 CFU/mL,优于ELISA检测方法,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门菌、李斯特菌、阪崎肠杆菌等均无交叉反应。在用于牛奶样本的模拟添加检测中,较ELISA方法可缩短前增菌处理时间。本研究为牛奶中O157:H7污染检测提供了一种准确度高、特异性强的检测手段。     

应用测试片快速检测食品中的大肠杆菌O157：H7

目的应用大肠杆菌O157:H7测试片快速检测食品中的大肠杆菌O157:H7。方法对大肠杆菌O157:H7测试片的各项指标及影响因素进行测试,并将其应用于食品检测。结果大肠杆菌O157:H7测试片的检测灵敏度高,其对纯菌的检测低限可达3cfu/mL;特异性较强,与鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌等21种非目的菌无交叉反应;快速,24h内可报告阴性检测结果。应用该测试片检测各种食品206份,检测结果与SN标准的符合率达到98.5%。结论应用测试片检测食品中的大肠杆菌O157:H7具有快速、方便、经济、无需昂贵设备等优点。该测试片可适应于食品中大肠杆菌O157:H7的快速初筛。     

大肠肝菌O157:H7紧密素研究进展

WHO不久前指出在过去的20年里,世界上出现了约30种新的传染病,1982年美国首次报告的由大肠埃希菌O157:H7引起的出血性肠炎就是其中之一。大肠肝菌O157:H7属于肠出血性大肠埃希氏菌(EnterohemorrhagicE.coliEHEC),尽管大肠杆菌O157:H7高致病力的机制尚未明了,但已确定紧密素(int     

检测冻肉中大肠杆菌O157∶H7的两种方法比较

大肠杆菌O157∶H7属于肠出血性大肠杆菌(en-terohemorrhagic E.coli,EHEC),是EHEC的主要血清型。感染大肠杆菌O157∶H7可使人患腹泻、出血性结肠炎,也可引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发征。笔者运用胶体金免疫(Colloidal gold immunoassay,GIA)检测卡和荧光PCR技术,对东莞市108份冻肉中的大肠杆菌O157∶H7进行了检测,并对2种方法的检测效果进行了分析比较。1材料与方法1.1材料东莞市各镇(区)冻肉库中的冻肉,共108份。大肠杆菌O157∶H7、O1、O48、沙门菌等菌株,由华南农业大学兽医学院郭霄峰教授惠赠…     

中药抗大肠杆菌O157:H7的筛选及其在体外瘤胃发酵中的应用

为了研究中药对肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7的抑制活性,为中药替代抗生素作为反刍动物饲料添加剂来抑制E.coli O157:H7等病原菌提供参考。采用水提法和醇提法从11种中药中提取抑菌活性成分,应用牛津杯法抑菌试验检测其抑菌能力,通过体外瘤胃发酵试验和RT-PCR评估其抑制E.coli O157:H7的应用效果以及半数致死量(LD_(50))来检验其毒性。结果显示,肉桂醇提液、丁香水提液、厚扑醇提液和黄芩醇提液对E.coli O157:H7抑制效果好、无毒(大鼠急性经口LD_(50)>15 000 mg/kg体重),但其抑菌具有广谱性。表明肉桂醇提液和丁香水提液具有代替抗生素作为反刍动物料添加剂抑制的应用前景。     

大肠杆菌O_(157)SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 (E.coli O157:H7)是一种强致病的病原性细菌,可引起出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征( HUS) 和血栓性血小板减少性紫癜( TTP)等[1].E.coli O157:H7对人的致病力较强,感染剂量较低,每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染.感染此病菌的人会出现严重腹泻、发烧等症状,病情严重者更会引起肾脏衰竭并发症,甚至导致死亡 [2],我国部分地区在食品和动物中有此类检测方面的报道 [3,4].     

大肠杆菌O157∶H7实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157∶H7快速定量检测的实时定量PCR方法。该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍。方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157∶H7,对非大肠杆菌O157∶H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应。利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157∶H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157):H_7及毒力基因的PCR检测

为了了解新疆不同牛场中大肠杆菌O157:H7的流行情况,对新疆乌鲁木齐、伊犁地区、塔城地区多个牛场采集的粪样及水样样本的检测,样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的疑似大肠杆菌O157:H7菌株做PCR检测,同时结合生化试验的方法进行符合性检验。结果从新疆3个地区不同牛场的208份样品分离得到5株肠出血性大肠杆菌O157:H7,检出率为2.4%。其中粪样检出5株,检出率为2.4%;水样未检出。生化试验结果表明,5株分离出的大肠杆菌O157:H7菌株与国标规定的O157:H7特性相同。表明,部分被检牛场存在大肠杆菌O157:H7威胁,应该引起重视。     

猪源大肠杆菌O157:H7广西分离株的鉴定

为了解大肠杆菌O157:H7是否在猪场存在,采集有拉稀症状猪的粪便,接种到新生霉素mEC增菌肉汤,增菌培养后转接到O157:H7显色培养基上,对可疑菌株用因子血清和PCR方法做进一步鉴定,实验结果证实得到5株大肠杆菌为O157:H7血清型。动物试验发现,5个分离菌株对小白鼠的致死率为33.3%—100%之间。调查结果证实广西猪群中存在强致病性的O157:H7血清型大肠杆菌。     

福建省猪源E.coliO_(157):H_7和O_(157):NM的药物敏感试验分析

O157:H7大肠杆菌是一种新发现的肠道致病菌 ,也是人兽共患病病原菌。国内外有关资料证明 ,家畜是 E.coli O157:H7的主要贮存宿主。我国近年来的调查表明 ,家畜中生猪 O157:H7的检出率显著高于其他动物 ,但至今对猪源 O157:H7的耐药特征和现状未见专题报道 ,以致未能深入了解其耐药性的发生、发展及对人兽造成的危害。为此 ,我们选择 33种抗生素 ,对本省 1 0 6株猪源 E.coli O157:H7和 E.coliO157:NM进行药敏试验 ,同时进行讨论。报告如下。1　材料与方法1 .1　菌株　 1 997— 2 0 0 1年从莆田、龙岩、福州、三明地区分离自猪粪便、猪…     

国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议

致泻大肠埃希氏菌O157:H7（STEC O157:H7）是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌,主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中,对身体健康造成很大危害,甚至引发死亡。食品中STEC O157:H7检测尤为重要。本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较,提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强,以便为该菌快速准确检测提供帮助,实现与国际标准化体系建设接轨,满足实验室检测需要。     

乳胶凝集试验快速检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究

通过将羧化聚苯乙烯乳胶与大肠杆菌O157:H7 Intimin蛋白单克隆抗体进行偶联,对最佳偶联抗体IgG量、最佳偶联时间等条件进行优化,建立了快速检测大肠杆菌O157:H7的乳胶凝集试验方法。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异、简便等优点,适于临床应用,为大肠杆菌O157:H7的快速诊断提供了技术支撑。     

畜禽产品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测

为了解大肠杆菌O157:H7在畜禽产品中的带菌情况,采集2个屠宰场、福州市部分超市及农贸市场上的畜禽产品(猪肉、禽肉、蛋、内脏)631份.采集的样品经改良EC新生霉素增菌肉汤增菌后,增菌液用快速检测试纸条和酶联免疫反应测试盒进行检测;菌液涂抹于山梨醇麦康凯琼脂平板和大肠杆菌O157显色培养基平板,选取可疑菌落用乳胶凝集试剂盒进行检测,结果均未检出大肠杆菌O157:H7.