种番鸭源禽坦布苏病毒分离鉴定及基因组序列分析

种番鸭是否感染禽坦布苏病毒颇受国内学者关注。本研究于国内外首次自表现产蛋下降的种番鸭卵巢中分离获得1株病毒（命名为WYZLJ-1359株）,经RT-PCR方法鉴定为禽坦布苏病毒。经比较分析该病毒与我国其他禽源分离株全基因组序列表明,种番鸭源分离株WYZLJ-1359主要分子特征未出现变异,与2010年以来我国分离的其他禽源分离毒株的核苷酸序列同源性均在98.4％以上,且亲缘关系非常近,遗传距离均在1.8％以下,远低于与2000年以前分离的坦布苏病毒分离株之间的遗传距离。以上结果表明,我国禽坦布苏病毒感染的宿主在不断增加,但病毒在不同品种家禽的传播过程中遗传较为稳定,基因组未出现基因的缺失或插入等变异现象。     

鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

鸭坦布苏病毒江门株的分离鉴定及其E基因系统进化分析

从2011年江门新会区某养鸭场产蛋下降鸭群中分离出1株鸭坦布苏病毒,命名为JM株。经RT-PCR检测、透射电镜形态学观察及动物回归试验,证明该病毒是引起该场蛋鸭群产蛋下降的病原。对该病毒E基因进行序列对比、进化分析后发现,JM株与我国华东地区最早发生的鸭坦布苏病毒亲缘关系最近,核苷酸相似性达99.1%以上,表明该病毒可能来自华东地区。     

鸭坦布苏病毒甲基转移酶的真核表达及鉴定

甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用.为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达.结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性.     

鹅源坦布苏病毒SHYG株的分离与鉴定

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。     

珠三角地区鸭坦布苏病毒的全基因序列测定与分析

【目的】了解2010年以来分离于珠三角地区鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus,DTMUV)GDNS2010.1、GDNS2010.2、GDZQ2012、GDPY2013株的分子特征.【方法】参考Gen Bank收藏的DTMUV JS804株,共设计合成11对特异性引物,扩增了4株病毒的全基因序列片段.【结果和结论】4株病毒全长约为10 990 bp,无Ploy(A)尾结构,仅含有1个大的ORF,共编码3 426个氨基酸,5'非编码区(5'UTR)各含有94 bp.在3'非编码区(3'UTR),GDNS2010.1、GDNS2010.2毒株在103 395~103 411 bp处缺失10个碱基.联合前期试验已测定的2株病毒序列(GDHZ2012.1、GDHZ2012.2),用DNAstar和MEGA6.0序列分析软件将6株病毒同Gen Bank收藏的国内的其他坦布苏病毒株比对,发现核酸序列相似性在98%以上,与Ntaya病毒和Sitiawan病毒相似性较大,相似性都在73%左右;与西尼罗河病毒、日本乙型脑炎病毒、黄热病毒等相似性皆低于63%.6株病毒囊膜蛋白E核酸序列相似性为97.5%~99.9%,推导氨基酸序列相似性在97%以上,其中同一地区分离的毒株相似性最高,达99.9%;在囊膜蛋白E154位存在一潜在的糖基化位点Asn-Try-Ser,在E蛋白结构域Ⅱ第E289位,极性带正电荷的Lys变为极性带负电荷的Glu,推测这一位点可能为病毒的毒力位点.     

鸭坦布苏病毒贵州株分离鉴定及其E基因生物信息学分析

从贵州三穗县某鸭场的病鸭病料中分离出1株坦布苏病毒(tembusu virus, TMUV),经鉴定将其命名为TMUV-GZ。为了解该分离株的生物学特性及其E基因的分子特点,测定TMUV-GZ株的半数胚致死量(ELD₅₀),将病毒接种至不同宿主细胞,观察其适应性与增殖能力;对E基因克隆测序并进行序列分析,对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明：TMUV-GZ株能导致鸡胚和鸭胚死亡,该分离株无血凝性,在鸭胚上的ELD₅₀为10^-2.63·(0.2 mL)^-1;该分离株能在Vero细胞、BHK-21细胞和DF-1细胞上增殖,对BHK-21细胞适应性最好。该分离株的E基因与泰国分离株DK/TH/CU-99核苷酸同源性最高,为98.3%;一级结构预测E蛋白的理论等电点为5.01,不稳定系数为39.5,为稳定蛋白质;二级结构预测该蛋白质以α-螺旋、β-折叠、β-转角较多,为亲水性蛋白质,可能存在10个优势抗原表位、2个跨膜区、3个结构域,无信号肽;三级结构预测该蛋白质模型结构与其他黄病毒E蛋白实验结构之...     

检测鸭坦布苏病毒乳胶凝集试验的建立及初步应用

以制备的鸭坦布苏病毒单克隆抗体致敏乳胶,建立检测鸭坦布苏病毒抗原的乳胶凝集方法。经优化后确定其最佳致敏抗体量为300μg、最佳致敏时间为3 h、致敏温度为37℃。以乳胶凝集试验和RT-PCR对73份自然感染病例进行检测,分别检出阳性27、31份,两者检出的阳性符合率为87.1％。本方法快速、简便,适用于基层应用。     

鸭坦布苏病毒LH株E蛋白基因的克隆与结构

采用分子克隆技术对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白基因进行克隆,同时运用多种生物学软件对该基因进行结构和生物学功能预测和分析.结果表明,本试验成功克隆了DTMUV LH株E蛋白基因,该基因包含一个1 500 bp的开放阅读框,编码500个氨基酸.遗传进化树分析表明,该蛋白与我国其他省份分离株的同源性很高.该蛋白的分子质量为54.3 ku,等电点为7.63,不存在信号肽序列,含有17个糖基化位点,有13个丝氨酸、4个络氨酸和8个苏氨酸的磷酸化位点.该蛋白存在跨膜区域,为亲水性蛋白.抗原位点分析表明,该蛋白有21个抗原肽段.本试验结果为E蛋白的生物学功能和致病机理的研究奠定重要的分子理论基础.     

白羽半番肉鸭坦布苏病毒的分离鉴定及结构蛋白基因分析

自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。     

鸭坦布苏病毒病的研究进展

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）病自2010年开始在我国流行,该病能引起蛋鸭产蛋率骤降、肉鸭发育迟缓甚至死亡,给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。自该病暴发以来,DTMUV迅速蔓延至我国大部分鸭养殖地区以及临近的东南亚地区。DTMUV宿主范围广泛,除了感染鸭、鹅等水禽和鸡、麻雀等其他禽类外,也可以感染哺乳动物,具有潜在的公共卫生安全风险。近年来研究人员在DTMUV相关的流行病学、与宿主的相互作用机理以及疫苗研制等方面取得了一些进展。综述了DTMUV病原学、流行特点、病毒感染引起的天然免疫反应以及疫苗研制等方面的研究进展,以期为未来DTMUV的深入研究及该病的综合防控提供借鉴。     

广州地区猫泛白细胞减少症病毒分离鉴定及全基因组遗传分析

【目的】分析广州地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPLV)的自然重组、跨宿主传播以及流行变异情况。【方法】采集疑似感染猫泛白细胞减少症病毒的猫粪便样品进行细胞分离,并对阳性病料提取基因组DNA,PCR扩增获得病毒的全基因组序列,并与Gen Bank中相关的参考毒株序列进行遗传进化分析,同时对VP2基因与NS1基因的主要氨基酸位点进行差异分析。【结果】成功获得2株猫泛白细胞减少症病毒及其全基因组序列。遗传进化分析显示,广州地区分离的猫泛白细胞减少症病毒FPLV-GZ01、FPLV-GZ02与我国其他分离毒株FPLV-XJ01、FPLV-HRB属同一分支,提示FPLV-GZ01、FPLV-GZ02由FPLV-XJ1进化而来;NS1基因系统进化树显示,FPLV存在与CPV-447重组的可能。主要氨基酸位点分析显示,FPLV在VP2基因中的主要氨基酸位点上的遗传变异比CPV保守;在NS1基因上发现FPLV-GZ01、FPLV-GZ02分别存在不同程度的氨基酸位点突变。【结论】广州地区分离的猫泛白细胞减少症病毒仍在不断地重组进化。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

鸭坦布苏病毒对雏鸭血清生化指标、细胞因子和病毒复制情况的影响(英文)

为了解鸭坦布苏病毒(DTMUV)的致病性,试验以1×10~4EID_(50)的剂量DTMUV肌肉注射5日龄樱桃谷雏鸭,采用生化指标检测试剂盒对血清样品进行生化指标检测,采用荧光定量PCR方法检测排毒情况、组织载毒量和细胞因子的变化情况。结果表明,DTMUV对肝脏、肾脏、心脏和肌肉组织都有严重损伤;DTMUV可以在肝脏、脾脏、肺脏、脑中增殖,并于攻毒后第5天在肝脏和脑中达到高峰,于攻毒后第9天后在肺脏和脾脏中达到高峰,且脑、肝脏、脾脏中病毒含量最高;攻毒后第1天DTMUV就可引起脾脏中γ干扰素(IFN γ)、α干扰素(IFN α)、白细胞介素6(IL-6)、β干扰素(IFN β)、白细胞介素1β(IL-1β)、Toll样受体7(TLR-7)、白细胞介素2(IL-2)、主要组织相容性复合体Ⅰ型(MHC-Ⅰ)、主要组织相容性复合体Ⅱ型(MHC-Ⅱ)细胞因子过渡表达,在脑中第1,2,3 d均引起促炎性细胞因子IL-6、IL-2的过度应答。     

鸭病毒性肝炎病毒NA株全基因序列测定及分析

应用RT-PCR方法分段扩增DHV-NA株cDNA,并进行基因组全序列测定及同源性等分析。结果显示DHV-NA株基因组全长7 692 bp(不包括PolyA),5'和3'非编码区长度分别为626 bp和316 bp,有1个单一开放阅读框架(ORF,627~7 376 nt),编码2 249个氨基酸;与I型DHV(DHV-Ⅰ)参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.3%~96.9%和97.8%~98.8%;与新型DHV(N-DHV)90D株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为72.6%和82.3%。表明NA株与DHV-Ⅰ参考株遗传进化关系较密切,而与N-DHV遗传关系较远。     

禽腺联病毒的分离及其基因组鉴定

为了获得用于重组载体构建的禽腺联病毒(AAAV),用无菌处理后的鸡粪便样品与鸡胚致死孤儿病毒同时接种SPF鸡胚,根据已发表的AAAV基因序列设计引物,用PCR对致死鸡胚的尿囊液进行检测,结果从1份样品接种的鸡胚尿囊液中扩增到预期大小的AAAV Rep和Cap基因片段;对纯化后的PCR产物进行序列测定,将所获序列与已发表的AAAV Rep和Cap基因进行比较,其核苷酸序列同源性分别为97．1％和94．6％;将PCR检测阳性的尿囊液进行鸡胚传代,用PCR对不同时间死亡鸡胚的尿囊液进行再次检测,结果均扩增到预期大小的基因片段;提取病毒核酸,电泳观察到约4．7kb的AAAV基因组。说明已成功地从鸡粪便样品中分离到1株AAAV,为重组AAAV载体的构建打下了基础。     

一株韩国新型DHV的分离及RT-PCR鉴定

从山东省某疑似鸭肝炎发病区分离到1株病毒JFX08,血清中和试验结果表明该分离毒与传统的Ⅰ型鸭肝炎病毒无交叉保护,分离毒回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。根据已公布的韩国新型(基因C型)DHV的序列设计合成一对引物,进行RT-PCR扩增,得到大小约414 bp的目的条带;测序分析发现,分离毒与传统Ⅰ型DHV之间的相似性较低,而与韩国新型DHV之间的相似性高达93.2%～94.0%;进化分析结果表明,该分离毒与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型DHV。     

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及N基因序列分析

[目的]了解引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒是否为变异株.[方法]从疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场采集死亡仔猪的肠黏膜及其内容物,将病料常规处理后接种VERO细胞,采用维持培养液加10 μg/mL的胰酶的方法分离培养.用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归实验以及部分序列分析等方法对分离株进行鉴定.[结果]病料在接入细胞第一代即出现病变,细胞肿胀变圆,形成合胞体,逐渐脱落,细胞病变明显.随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐稳定,进行RT-PCR检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验,最终确定分离株符合PEDV特征,并命名为BJ2015,测定毒株的TCID50为10-6.4/0.1 mL.基因测序结果显示,N基因长1 329 bp,编码442个氨基酸.与参考株N基因核苷酸序列比对及遗传进化分析表明,BJ2015与传统株CV777亲缘关系较远;与流行变异株BJ-2011-1N基因在进化树的同一个分支上,二者的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％、99.5％,表明BJ2015与BJ-2011-1亲缘关系较近.[结论]结果表明BJ2015为PEDV流行性变异毒株.