杨树SRK2C基因的克隆及其遗传转化

在杨树全基因组序列信息的基础上,根据拟南芥渗透胁迫诱导基因SRK2C的全长cDNA序列,在杨树基因组上定位并克隆获得了3个SRK2C同源基因全长cDNA序列.运用Gateway定向克隆技术构建了杨树SRK2C基因的过量表达载体,并进行了T89杨遗传转化研究,获得了一批转SRK2C基因T89杨植株,PCR检测表明目的基因已经整合到了杨树基因组中,实时定量荧光RT-PCR结果也进一步证实,目的基因在T89杨转基因植株中有较高水平的表达丰度.为进一步分析杨树PtSRK2C基因功能奠定了基础,也为进一步开展林木的抗逆机制和林木抗逆遗传改良研究提供了依据.     

菜豆几丁质酶基因Bchi的克隆及其在转基因烟草中的表达

本文根据GenBank中公布的菜豆几丁质酶基因cDNA序列设计引物,通过RT-PCR得到一个菜豆几丁质酶基因家族基因Bchi.该基因编码一个327个氨基酸的多肽,其结构包括信号肽、几丁质结合区、铰链区、催化区和液泡定位多肽,属于Class Ia类内切几丁质酶.构建该基因的植物表达载体pMHL7133-Bchi,并通过发根农杆菌R1000介导转化烟草,经PCR和Southern blot鉴定获得了4株转基因烟草株系.几丁质酶活性分析表明,转基因烟草几丁质酶活力明显高于对照.抗真菌实验结果显示,转基因烟草的叶片基本无病斑产生,表明Bchi基因在烟草中高水平的表达显著提高了烟草对真菌病害的抗性.     

两个棉花几丁质酶基因的克隆与表达分析

 从棉花黄萎病缩减杂交库中得到了分属Ⅲ型和Ⅳ型几丁质酶的两个片段,它们都具有完整的3’末端。通过RACE与RT-PCR结合获得了这2个基因完整的读码框序列。其中Ⅳ型几丁质酶的开放读码框为678 bp,编码长为226个氨基酸的蛋白,命名为Ghachi4;Ⅲ型几丁质酶的全长为1390 bp,编码长为298个氨基酸的蛋白,命名为Ghachi3。它们与拟南芥同源基因的相似性分别达到65%和71%。利用网上分析软件发现这2个基因都有信号肽序列,并预测编码的蛋白位于胞质体外。半定量RT PCR发现Ghachi3在花、蕾和韧皮部中的表达量较高,而Ghachi4在韧皮部表达量最高。Ghachi4仅在抗病品种受黄萎病和枯萎病的诱导后表达上调,而Ghachi3还在感病品种中受黄萎病的诱导表达。同时,在常抗棉中2个基因的表达都受到ABA的强烈诱导。推测这2个基因可能参与生物胁迫或非生物胁迫的防御反应。     

卵寄生真菌虫草棒束孢几丁质酶基因IFCHI1的克隆与分析

为研究卵寄生真菌在寄生并破坏卵的过程中几丁质酶的作用,本研究从烟草南方根结线虫卵上分离得到虫草棒束孢HNE3,采用RT-PCR及RACE技术,首次克隆得到一个几丁质酶基因IFCHI1。该基因DNA序列全长1 417 bp,具有1个内含子,长度为61 bp,包含1个1 185 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由394个氨基酸组成的蛋白。通过在线软件分析,该蛋白理论分子量为44.1 k Da,等电点为4.88。通过Gen Bank比对,几丁质酶IFCHI1属于第18家族糖基水解酶,比对分析不同来源真菌几丁质酶,发现该几丁质酶具有典型的催化区保守序列SIGGW和FDGIDIDWE及结合区保守序列GTWEQGVYDY和GLGGAMWWESS。同源性比对发现,该几丁质酶同昆虫寄生真菌几丁质酶同源关系近。结果表明,从虫草棒束孢HNE3克隆得到几丁质酶基因IFCHI1,为进一步明确该菌产生的几丁质酶对南方根结线虫卵壳降解及降低孵化率的作用机理提供理论依据。     

甘薯几丁质酶基因IbChiA启动子的克隆及功能分析

几丁质酶能够水解真菌细胞壁,抑制真菌的生长与繁殖,水解产物还能诱导植物的系统抗性,在植物抗病过程中发挥重要的调控作用。本实验室前期从甘薯中克隆了几丁质酶基因IbChiA并对其进行了功能验证和表达分析,结果表明黑斑病菌强烈诱导IbChiA基因的表达,且在不同抗性甘薯品种中的表达差异显著。在此基础上,本研究在抗感品种中分别克隆了IbChiA基因的2 034 bp的启动子序列,对比后发现其序列并无差异。PlantCARE在线分析显示,IbChiA启动子中包含核心元件TATA-box和CAAT-box,还有响应真菌诱导的作用元件(W-box)以及植物激素等相关的顺式作用元件。将IbChiA基因的全长启动子及7个启动子5’端缺失片段分别替换植物表达载体pHB的2xCaMV 35S启动子,并在本生烟草叶片中进行瞬时表达。eGFP的荧光及定量表达分析显示在基因上游600 bp及以上都能够正常稳定地发挥启动子的功能,其中在-1 605～1 188 bp的片段内可能存在增强转录的顺式作用元件。本研究为进一步探索甘薯IbChiA基因的调控和表达机制提供了理论依据,并为甘薯抗病基因工程提供了一个理想的候选启...     

杨树Ptann3基因克隆与表达特性分析

膜联蛋白(Annexin)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,在非生物逆境胁迫方面发挥重要作用,但木本模式植物杨树膜联蛋白基因的研究还未见报道。本研究通过RT-PCR与RACE相结合的方法从毛果杨(Populus trichocarpa)克隆获得膜联蛋白3 (Ptann3)基因c DNA序列,分析发现编码蛋白质Ptann3与其他植物膜联蛋白高度同源,具有过氧化物酶活性结构域、S3氧化还原反应结构域、GTP结合结构域及钙结合位点。构建原核表达载体p ET-28a-Ptann3,转入大肠杆菌BL21 (DE3)中表达分析,Ptann3蛋白分子量35.6 kD,分析表明Ptann3蛋白具有过氧化物酶与ATPase活性。qPCR分析结果显示,Ptann3基因在根、上部茎、下部茎、叶柄、幼叶和成叶中均有表达,在幼叶中表达量最高,在叶柄和根中表达量次之,成叶和茎中表达量最低。此外,研究发现低温、ABA、PEG6000、H2O2和NaCl胁迫处理可显著影响Ptann3基因的表达,推测杨树Ptann3基因在非生物逆境胁迫中发挥重要作用,研究结果对杨树抗逆遗传改良具有重要意义。     

伽师瓜和86-1甜瓜几丁质酶基因的克隆与序列分析

以新疆主产不同耐藏性的甜瓜品种伽师瓜(耐藏性好)和86-1甜瓜(新密11号,耐藏性差)为试料,利用甜瓜基因组辅助设计引物克隆几丁质酶基因的c DNA序列,分别对其编码序列(CDS)及编码氨基酸进行相关生物信息学的预测分析,以期通过研究二者之间基因的差异揭示伽师瓜和86-1甜瓜采后不同耐藏性的机制。结果表明,获得的伽师瓜几丁质酶基因(Jia Shi Melon chitinase,JSMC2),NCBI检索号为KT921406;86-1甜瓜几丁质酶基因(Xin Mi-11 melon chitinase,XMMC),NCBI检索号为KU236388。JSMC2和XMMC序列长度均为1 011 bp,包含完整的开放阅读框,编码336个氨基酸,与黄瓜几丁质酶基因具有高度的同源性。蛋白结构域预测分析表明,甜瓜几丁质酶蛋白包含GH18_hevamine_Xip I_class_Ⅲ、Chi1、GH18_chitinase-like super family、Glyco-hydro-18和Glyco_18保守结构域,可催化几丁质水解成N-乙酰葡糖胺,分解真菌细胞的细胞壁,抵御病原真菌的侵染。     

黄瓜几丁质酶基因克隆及与白粉病抗性关系的初步研究

本研究采用常规PCR技术在黄瓜抗白粉病品种JIN5-508中克隆得到几丁质酶基因,并利用荧光定量PCR分析该基因在接种白粉菌后的表达变化。研究结果显示:接菌后几丁质酶基因表达量明显上升,在24 h达到最高值,是其对照的7倍;接菌24 h后,几丁质酶基因表达量迅速下降,最终与对照趋于一致。从具有不同抗白粉病特性的品种中克隆得到几丁质酶基因并进行同源性比对,获得4个多态性位点,对品种间几丁质酶基因开放阅读框(ORF)所编码的氨基酸序列进行了比对,发现了2个氨基酸差异位点,其中抗感白粉病品种在第557个碱基位点即第184个氨基酸位点上存在差异。进一步以抗病品种JIN5-508与感病品种D8杂交得到的F2代为材料,从苗期(2~3片真叶)人工接种白粉菌,1周后根据幼苗发病情况鉴定出F2代中表现为抗病的植株和感病的植株,并以此为材料克隆几丁质酶基因,成功克隆得到F2抗与F2感的几丁质酶基因,发现F2抗性植株中克隆到的几丁质酶基因差异氨基酸位点处的氨基酸与抗病品种一致,而从F2感病株中克隆得到的几丁质酶基因差异氨基酸位点处的氨基酸与感病品种一致。研究结果表明,几丁质酶基因与黄瓜的白粉病抗性密切相关,可利用此差异位点进一步发展与黄瓜白粉病相关的功能性分子标记。     

白粉菌(Erysiphe graminis)侵染诱导表达的小麦糖苷水解酶基因TaGlc2的克隆与鉴定

真菌病害是世界小麦生产中的最重要的病害之一。目前,在小麦中已经鉴定出一批小麦病菌侵染诱导基因,包括病程相关基因和抗真菌水解酶基因（葡聚糖酶基因和几丁质酶基因）。最近的研究表明,植物1,3-β-葡聚糖酶参与对真菌侵染的防卫。本研究从小麦cDNA文库中克隆出一个编码小麦1,3-β-葡聚糖酶的新基因,命名为 TaGlc2。该基因编码的氨基酸序列与糖苷水解酶基因家族17高度同源。采用实时定量PCR分析方法对TaGlc2基因在白粉菌侵染(Erysiphe graminis)后小麦叶片中的表达模式进行研究,发现TaGlc2基因在白粉菌侵染6 h后表达明显增强,至24 h达到峰值,说明该基因受白粉菌侵染诱导表达。还获得了TaGlc2基因5'上游调控区序列,发现存在与病菌侵染响应有关的顺式元件。小麦TaGlc2基因在小麦白粉病抗性上可能具有重要作用。     

棉花精氨酸酶基因GhARG1 cDNA的克隆与表达分析

为了深入研究棉花精氨酸酶基因对非生物胁迫的响应以及生理功能,利用电子克隆和RT-PCR技术从棉花中获得了精氨酸酶ORF序列Gh ARG1,盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA和MeJA处理棉花幼苗,并原核表达棉花精氨酸酶基因。生物信息学分析表明,其ORF序列长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,具有典型的精氨酸酶保守结构域。q RT-PCR技术分析表明,在叶片中该基因转录水平上受盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA处理的诱导,而对MeJA下调其表达。将Gh ARG1完整的编码序列融合到原核表达载体p Cold-TF中,经过IPTG诱导及SDS-PAGE检测表明,Gh ARG1编码产物的分子量约为37 ku,与预期相符。p Cold-Gh ARG1重组菌粗酶液中精氨酸酶活性是对照菌的6倍。研究表明,棉花内源性精氨酸酶基因Gh ARG1可能通过ABA、SA信号途径参与棉花对盐渍和干旱胁迫的响应,且其克隆表达产物具有精氨酸酶活性,为开展其生理功能研究奠定了基础。     

水稻几丁质酶基因的转录与表达特征

几丁质酶与植物的生长发育、抗逆和防御反应相关。水稻PR3家族几丁质酶编码基因有19个成员,本文分析其转录特征,了解到有些基因属于组成型转录,有些基因属于组织特异型转录,分析了几丁质酶蛋白质的结构域,并对其进行了聚类和亚家族分类分析。利用免疫印迹技术分析了几丁质酶蛋白质的表达谱,发现CHIT5的表达量在水稻叶片生长过程中下调,而CHIT6、CHIT14、CHITC1和CHITC2的表达量上调。在水稻与白叶枯病菌(Xoo)的不亲和反应中,CHIT1、CHIT2、CHIT5、CHIT6、CHIT10、CHIT15和CHIT16的表达量上调,CHIT14、CHITC1和CHITC2的表达下调。进一步比较几丁质酶蛋白质在水稻-Xoo不同互作反应中的表达,发现其在亲和及不亲和反应中的表达模式类似,但一般在亲和反应中强度变化较大。此外,CHIT6蛋白质在对照反应中的表达量上调,提示CHIT6的表达受创伤的诱导。本文比较系统地揭示了水稻PR3家族几丁质酶编码基因的转录和蛋白质表达特征,为其功能解析提供了线索。     

紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析

本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.     

维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建

几丁质和β-1,3-葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份,可分别被几丁质酶(Chitinase,Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,Glu)降解,而且它们具有协同抗真菌的作用,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶存在于大多数植物细胞中。在正常情况下,植物体内的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶只有低水平的组成型表达,但在病原菌侵染、诱导物刺激及各种伤害下可诱导产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。而真菌病害是危害植物的主要病害之一,这些病害主要通过韧皮部运输而进一步扩展到其他部位。如果利用维管特异表达启动子调节目的基因在韧皮部高效特异地表达,就可以更为有效地发挥目的基因的作用。为此,克隆了维管特异BSP启动子和Chi、Glu基因,并构建了以BSP驱动的Chi和Glu基因的双价表达载体pBIBCG。重组质粒pBIBCG经过PCR分析鉴定,结果表明,以维管特异启动子BSP驱动的含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功,为植物抗真菌基因工程育种奠定了基础,对提高植物的整体抗病性具有重要的作用。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库,选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列,利用电子延伸和RT-PCR方法,获得一个开放阅读框为1 434 bp,编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸）,但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350）,因此,将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明,TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示,TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应,但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h,基因的表达量已达到对照的30倍,之后其表达量迅速回落,但仍高于对照;受ABA诱导时,其表达量略有增加,在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

菜用大豆蔗糖合酶基因鉴定及表达模式分析

蔗糖含量是影响菜用大豆甜味的主要因素。蔗糖合酶(sucrose synthase, SUS)是调控蔗糖代谢的关键酶之一,在作物品质调控等方面发挥重要作用。为了深入了解菜用大豆蔗糖代谢相关GmSUSs基因的分子作用机制,本研究从基因组水平对GmSUSs进行了基因成员鉴定、蛋白理化特性、保守结构域、进化关系、基因结构、启动子元件组成、组织表达模式及激素和胁迫表达谱分析。结果表明:从全基因组水平共鉴定到11个GmSUSs编码蔗糖合酶。蛋白多序列比对显示所有GmSUSs均含有保守的特征结构域:Sucrose_synth和Glycos_transf_1。进化分析显示GmSUSs主要划分为3个分支。组织表达分析显示不同GmSUSs基因在不同生长发育阶段的表达量具有明显差异。启动子顺式作用元件分析显示GmSUSs基因上游启动子区内激素和胁迫应答元件组成各异。进一步,qRT-PCR分析显示激素(ABA, ACC和NAA)和胁迫(低温,高温和干旱)处理诱导GmSUS11基因表达。以上实验结果为菜用大豆GmSUSs基因功能解析及蔗糖代谢途径改造提供了参考。     

茉莉酸甲酯对人参β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的影响

为了明确β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在茉莉酸甲酯（MeJA）诱导人参抗人参锈腐病过程中的作用,试验设4个处理：MeJA、Cylindrocarpon destructans、MeJA+Cylindrocarpon destructans和CK。MeJA浓度为200 mg/L。处理后3,6,9,12,15,20,25,30天测定酶活。结果表明,经MeJA处理后接种人参锈腐菌,人参根系β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性均较对照增强。β-1,3-葡聚糖酶活性在第12天达到峰值,是对照的1.39倍;几丁质酶活性在第15天达到峰值,是对照的1.51倍。这表明β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在MeJA诱导人参抗人参锈腐病的过程中起重要作用。     

大豆胁迫相关蛋白GmSAP3基因的克隆和表达分析

胁迫是影响植物生长发育和农作物产量的重要因素.胁迫相关蛋白(stress associated protein,SAP)是一类锌指蛋白,广泛参与植物发育和胁迫响应.为了研究大豆SAP基因的功能,本研究以'商豆1201'为材料克隆了GmSAP3基因,并进行了生物信息学分析,采用RT-PCR分析该基因在大豆不同组织和温度胁迫下的表达模式.结果 表明,GmSAP3基因CDS序列全长为513 bp,编码170个氨基酸,GmSAP3蛋白等电点pI为6.79,分子量为18.30568kD;序列分析发现,GmSAP3含有2个保守结构域(zf-A20和ZnF-AN1),序列比对和进化分析发现GmSAP3与GmSA P26亲缘关系最为接近.RT-PCR结果表明,GmSAP3在大豆不同组织中均有表达,其中根和叶片表达较高;GmSAP3受高温胁迫诱导表达,推测该基因在大豆胁迫响应中具有重要作用.本研究为GmSAP3基因功能研究提供了一定的理论支持.     

霜疫霉诱导的荔枝果皮几丁质酶活性及其基因表达分析

为探究荔枝果皮几丁质酶对霜疫霉病抗性中的功能,本研究以抗病品种‘黑叶’和感病品种‘桂味’为试验材料,分析荔枝果皮中的几丁质酶活性和基因表达情况。结果表明,果皮中几丁质酶活性不同,其与品种的抗病性正相关,霜疫霉菌侵染提高了果皮中酶活性。基于转录组数据,共检测到75条几丁质酶基因,在系统进化树上分为3枝。接种霜疫霉的抗病和感病品种果皮中差异表达基因有58条,表明几丁质酶基因响应霜疫霉入侵表达。不同进化分枝上的3个基因的表达水平因抗病性和接种时间的差异表达模式不同。LcChi3-1基因在抗病品种‘黑叶’中的表达水平远远高于感病品种‘桂味’,‘黑叶’果皮中LcChi3-1基因的表达水平与酶活性具有显著的相关性,表明其参与了对霜疫霉菌的抗病过程,并发挥主要作用。     

苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达分析

为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家族的保守功能域,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β-转角较少。VmGluI编码氨基酸序列与苹果和梨树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因(KUI68239.1和KUI56905.1)同源性最高,分别为98.7%和87.8%,而与非植物病原真菌β-葡萄糖苷酶基因亲缘关系较远。接种苹果树腐烂病菌的富士枝条中,VmGluI显著上调表达,推测其在腐烂病菌侵染致病过程中起重要作用。离体枝条接种48 h后基因表达量开始显著升高,72 h时表达量最高为对照6.3倍;活体枝条接种12 h后,基因表达量已为对照的11.2倍,接种后48 h基因表达出现低谷,但96 h时表达量为对照的16.8倍,表明苹果树腐烂病菌在侵染离体和活体枝条过程中,VmGluI表达水平和时序变化存在明显差异。     

棉花酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因的发掘及在非生物胁迫抗性中的功能鉴定

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生长发育、响应逆境胁迫及生物膜修复等方面具有重要作用。本研究基于陆地棉(Gossypium hirsutum)遗传标准系TM-1基因组序列信息,鉴定并获得21个棉花ACBP家族基因成员的全序列和染色体定位等信息。聚类分析表明这21个基因分属于I~IV类。依据与拟南芥的同源性,将棉花ACBP家族基因命名为GhACBP1~GhACBP6等6大亚类。转录组分析表明,该家族基因在不同组织、不同发育时期表达差异较大。不同逆境诱导分析表明,GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6显著受盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导,而GhACBP4和GhACBP5对逆境胁迫响应不强烈。进一步分析表明,GhACBP3和GhACBP6的表达受过氧化氢(H2O2)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)的诱导。病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验表明,沉默GhACBP3和GhACBP6亚类基因会降低棉花植株对干旱和盐的耐性。目标基因沉默后,植株干物质积累下降,株高变矮,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高,表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐盐中发挥作用。研究为利用ACBP家族基因进行棉花抗逆性研究及应用提供参考。