植物激活蛋白对烟草花叶病毒RNA复制及外壳蛋白合成的抑制作用

研究了植物激活蛋白对烟草花叶病毒RNA及外壳蛋白的抑制作用。结果表明，烟草经植物激活蛋白处理后，植株体内烟草花叶病毒RNA含量比对照降低28％；用ELISA和Western方法检测烟草花叶病毒外壳蛋白的含量，处理分别比对照减少20．7％和25．0％。植物激活蛋白显著干扰烟草花叶病毒外壳蛋白的体外聚合过程，22—37％条件下其干扰作用达显著水平。     

基于外壳蛋白基因的湖南烟草黄瓜花叶病毒遗传多样性分析

为探明湖南烟草上发生的黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的遗传多样性及分子进化特征,对来自湖南烟区的303份疑似感染病毒的烟草样品进行检测,分析CMV系统发育、遗传变异和群体结构等特征。结果表明：部分分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)基因与NCBI上登录的CMV分离物的一致性为86.34%～98.42%;系统发育分析发现湖南烟草CMV分离物属ⅠB组,不同组间的分离物地理特征不明显,无重组现象,进化的主要驱动力是负选择;组间遗传变异比较明显,基因交流频率较低,受到遗传漂变影响,遗传多样性高,群体趋于扩张。研究结果为烟草抗CMV育种提供了理论依据,对病害防治具有重要意义。     

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

 从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒,接种6科31种鉴别寄主,能侵染5科22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片,用0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)匀浆后汁液加4% PEG-8000沉淀3h,5%~40%甘油梯度离心纯化病毒,可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒,长度740nm左右。病毒提纯液于264nm处有一吸收峰,为典型的核蛋白紫外吸收。TuMV-H分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的PCR引物扩增其外壳蛋白基因,可得-0.9Kb的片段。     

建兰花叶病毒外壳蛋白基因和3′UTR序列测定与分析

采用单链构象多态性分析从建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)的8个分离物筛选得到5个存在遗传变异的分离物,并测定了外壳蛋白(coat protein,CP)基因和3'非编码区(3'UTR)序列,经序列分析表明5个分离物与其他分离物间的CP核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87,1％～99.9％和91.1％～99.6％,属于亚组A成员.CP基因不同片段受到正选择压力的作用不一样,C端受到负选择压力的作用不易发生变异,而N端受到正选择压力的作用容易发生变异.通过RNAsharpes软件分析3 'UTR序列发现各分离物均形成带有Potexvirus属保守核苷酸序列“AC(C/T) TAA”的三叶草茎环结构,这种结构的功能可能与病毒RNA复制有关.     

基于外壳蛋白基因序列对3种葫芦科作物病毒的分子分析

 从山西运城的南瓜(Cucurbita moschata)、河南开封和孟津的西葫芦(Cucurbita pepo)上通过ELISA分别检测到南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus-Watermelon type,PRSV.w),通过接种分离纯化获得其病毒毒原(CH99/211,CH99/113,CH99/69)。本研究克隆了这3个分离物的外壳蛋白基因,应用DNAStar、Clustal X、Phylip等分析软件将这些序列同已报道的相应序列进行分析并构建系统树。结果发现SqMV可以分为两个组,CH99/211分离物与美国的Arizona分离物接近,应属于z组;WMV分为两个组,CH99/69同国内黑龙江分离物(WMV-HLJ)和云南分离物(WMV-CHN)最接近,成一小簇;PRSV分成两个组。CH99/113属于Ⅱ组,与国内SP、MZ和BN分离物接近。序列分析表明PRSV和WMV在进化上具有地理相关性。SqMV和PRSV-W外壳蛋白基因序列分析属国内首次报道。     

烟草品种对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的抗性鉴定

 2010-2011年采用大田人工接种鉴定的方法,对生产中大面积推广使用的24份烟草品种进行了烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性鉴定。结果表明,供试品种对TMV和CMV的抗病性存在较大差异,对TMV表现抗病的有Coker86、吉烟5号、Coker176、CV87、辽烟8号、CV91、中烟90等7份材料;表现中抗的有秦烟98、双抗70、C151等3份材料;表现中感的有秦烟96、G80、金星6007、龙江981、K326、秦烟201、NC89等7份材料;表现感病的有G28、云烟97、净叶黄、红花大金元、RG11、云烟85、云烟87等7份材料。对CMV表现抗病的有Coker86、龙江981、C151、秦烟201、云烟87等5份材料;表现中抗的材料是金星6007;表现中感的有CV91、RG11、Coker176、中烟90、K326、红花大金元、净叶黄、G80、G28等9份材料;表现感病的有秦烟98、云烟85、秦烟96、NC89、双抗70、云烟97、CV87、辽烟8号、吉烟5号等9份材料。其中兼抗TMV和CMV两种病毒病的材料有2份,分别是Coker86和C151。同时研究还发现,抗病性不同的烟草品种在受到病毒危害以后,对烟叶的产量和品质的影响也不同。明确了中国24个烟草品种的抗病性水平,为抗病品种的利用与品种合理布局提供科学依据,同时为烟草抗病毒病育种的亲本选择提供抗源信息。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒山西西瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

通过病毒dsRNA分离技术、非序列依赖性PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)技术和RTPCR等手段对采自山西太谷的西瓜病样进行了检测与鉴定,确定其为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)所侵染。为明确CGMMV西瓜分离物(CGMMV-SXTG)的分类地位,本研究进一步克隆了CGMMV-SXTG的外壳蛋白基因(coat protein,CP)全序列并进行序列分析,系统进化树分析显示该分离物与亚洲分离物亲缘关系较近,而与欧洲分离物亲缘关系较远,表明该病毒的不同分离物在分组上可能与地域有一定的关系;接着对不同分离物的CP基因核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比对分析,结果表明该分离物与中国山东分离物(TANG)同源性最高,分别达到99.8%和99.6%。     

除草剂分子靶标研究进展

除草剂销售额占全球农药总销售额的一半以上。然而,除草剂长期、大量的使用,导致杂草的抗药性日益严重。因此,除草剂新分子靶标或新作用机制的发现就显得尤为迫切。鉴于此,本文总结了近几十年来现有除草剂分子靶标的种类、生物化学功能和三维结构的研究进展,以及代表性商品化的除草剂。在此基础上,对除草剂分子靶标发现的现状以及新技术进行了展望。本综述可为除草剂分子靶标的发现以及绿色除草剂的创制提供一定参考。     

接种烟草花叶病毒后不同抗性番茄品系叶片可溶性蛋白组成的变化

 用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析了不同抗性番茄等基因系GCR-267和GCR-267的叶片可溶性蛋白组成在接种TMV番茄O株后的变化。实验发现敏感品系GCR-26的叶片可溶性蛋白的组成,与健株相比较,TMV侵染株发生显著的变化。接种后7天,除一部分蛋白质含量减少外,还有四种为健株及抗性品系TMV接种株所没有的新蛋白质产生,它们在10%凝胶上的迁移率分别为Rf0.31、0.33、0.39和0.45,其中Rf0.38和Rf0.39两种蛋白质含量极大。接种后10天Rf0.31和Rf0.45两带趋于消失,但Rf0.33和0.39两带继续积累。经电泳和免疫双扩散试验证明Rf0.33蛋白带是TMV外壳蛋白:Rf0.39蛋白带与TMV外壳蛋白无关。该蛋白也不具有过氧化物酶,多酚氧化酶、酸性磷酸酶、酯酶、苹果酸脱氧酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶的催化活性,分子中不含有糖类物质。SDS-PAGE测定其分子量为14,200道尔顿。
抗性品系GCR-267的TMV接种株的叶片可溶性蛋白组成未出现象感病品系GCR-26那样的变化。
讨论了这种变化与番茄抗、感病性之间的关系。     

TMV侵染后的烟草细胞膜蛋白结构变化的研究

为探明病毒侵染对烟草细胞膜的损伤作用 ,采用圆二色波谱仪 (CD)分析了被 TMV侵染的烟草细胞膜蛋白结构的变化 ,以及右旋紫草素对感病烟草细胞膜的作用。结果发现 ,被 TMV侵染的烟草细胞膜蛋白分子二级结构发生变化 ,表现为 α-螺旋的减少和 β-转角的增加 ;用右旋紫草素处理的感病烟草细胞膜蛋白分子二级结构的变化 ,表现为药剂作用比感病样品的细胞膜蛋白的二级结构中 α-螺旋成分比例增加 ,而 β-转角比例相应减少。     

甘蔗花叶病毒福建分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 A fujian isolate of Sugarcane mosaic virus named SCMV-FJ was isolated from infected sugarcane. Cloning and sequence analysis of the coat protein gene of this isolate was carried out. A pair of primers was designed and synthesized based on the nucleotide sequences of coat protein genes of sugarcane mosaic viruses reported. The coat protein gene of SCMV-FJ was amplified from the extracted total RNA of the infected sugarcane by using RT-PCR, and cloned into the pMD18-T vector. The sequencing result indicated that the cloned segment included a 1137 bp open reading frame(ORF) and a 228 bp 3' untranslated region, in which the ORF comprised the whole coat protein and part of the nuclear inclusion b. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene were compared with those of the other isolates or strains of SCMV subgroup reported in GenBank. The result showed that it shares 56.8%-97.1% and 55.3%-99.4% homology in nucleotide and the putative amino acid sequences, respectively, with the highest amino acid homology of 99.4% with SCMV-D. Thus it was identified as a SCMV-D. This experiment provided a rapid, sensitive and relatively inexpensive method for RT-PCR detection of SCMV. At the same time, the cloning of SCMV-FJ coat protein gene provided the foundation for plant gene engineering against SCMV.     

芜菁花叶病毒对油菜致病力差异及壳蛋白基因序列分析

 2004年春季参试的湖北、安徽2省11个芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)分离物感染4个油菜品种,病情指数幅度为26.2~76.0;秋季参试5个TuMV分离物感染14个油菜品种,病情指数幅度为38.3~55.9,均值方差分析表明,致病力差异分别达到极显著和显著水平。壳蛋白(CP)基因序列分析表明,来源于2省油菜、白菜、红菜薹、芝麻和萝卜的17个TuMV分离物与浙江分离物ZJB3序列同源性在97%以上,同属于MB类群;而另一个萝卜分离物WRS1与ZJR1、CH1和CH2分离物序列同源性在95.4%~98.7%之间,属于MR类群。类群间分离物序列同源性仅为88.0%~92.2%。遗传进化树分析表明,萝卜分离物WRS2在MB类群中单独构成一个分支,可能是MR类群和MB类群发生重组的后代。     

藜草花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与RT-PCR检测

 The nucleotide sequence of coat protein (cp)gene of Sowbane mosaic virus (SoMV)was determined. The cp gene of SoMV consists of 726 nucleotides and encodes a putative protein of 241 amino acid re-sidues. Sequence comparison showed that SoMV was most closely related to Rubus chlorotic mottle virus compared to other sobemoviruses. A primer pair was designed for the detection of SoMV based upon the determined cp nucleotide sequence. An expected fragment with 510 bp could be obtained from SoMV, while no specific band was observed from the healthy control. The result showed that the RT-PCR assay with the primer pair was suitable for the specific detection of SoMV.     

侵染扶桑的烟草花叶病毒分离物鉴定

从表现叶斑驳症状的扶桑病株上获得一病毒分离物,电镜下可见约300 nm×18 nm的杆状粒子,其与烟草花叶病毒抗血清呈明显的阳性反应,dsRNA约为6.4 kbp。根据烟草花叶病毒(tobacco.mosaic virus,TMV)的RNA序列设计引物,进行RT-PCR检测,扩增出约800 bp的预期特异片段。将PCR产物连接pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,得到了含有目的片段的重组子。序列分析表明,与周雪平等报道的序列(GenBank AJ011933.1)同源性达99％。通过生物学、病毒粒子观察、血清学以及分子生物学实验结果,确定该病毒分离物为TMV。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)主要危害葫芦科作物,已被世界上许多国家和地区列为检疫性有害生物。CGMMV目前在我国23个省、市、区已有报道发生和危害,严重影响葫芦科作物的生产;近年来该病害在国内外呈现迅猛扩展的趋势并对生产造成危害。本文综述了防治该病害的种子处理、化学及生物防治、嫁接以及转基因等分子生物学方法;分析了CGMMV与寄主黄瓜互作研究的最新进展,对小分子RNA参与调控寄主对CGMMV病毒的防控策略提出了展望,并概述了下一代测序技术、基因编辑技术在植物新病毒的检测、鉴定以及培育抗病新品种等方面的应用。     

基于CP基因的中国云南省烟草TMV群体遗传多样性分析

为探明云南烟草上烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的群体遗传多样性特征, 本研究使用TMV外壳蛋白(coat protein, CP)基因的特异性引物对采自云南各烟区的疑似烟草花叶病样品进行检测, 通过克隆测序获得138个TMV CP基因序列, 对其进行了一致性比对, 及系统发育、错配分布、遗传变异、群体多样性等分析。变异分析显示, 138条CP基因序列共有变异位点数122个, 占总位点数的25.42%, 变异类型只有核苷酸替换, 核酸多样性为0.018, 单倍型多样性为0.970;一致性比对结果显示, 138条序列的核苷酸和氨基酸序列一致性均为96%～100%; 重组分析未检测到重组信号;对来自云南烟草, NCBI上其他地区烟草及云南地区其他寄主的TMV分离物的CP基因进行系统发育分析, 结果显示, 所有TMV分离物在进化上可分为4个组, 本试验获得的分离物分布在1、2、3组, 其中只有来源昭通地区的分离物倾向于聚成簇, 表明云南烟草TMV分离物的适应性进化受地理适应性所驱动, 与寄主适应性基本无关;错配分布分析显示, 云南烟草TMV群体呈多峰分布, 表明该群体近期未经历群体扩张事件; 群体间遗传分化分析结果表明, 除昭通和曲靖烟草TMV群体与其他TMV群体之间很容易发生遗传漂变促使群体发生遗传分化外, 其余大部分TMV群体之间的基因流都可以抵制遗传漂变。本研究首次报道了云南各烟区TMV分离物群体遗传变异情况, 研究结果可为TMV的抗病育种和制定更为有效的防治策略提供重要参考。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白的表达、纯化与结晶条件筛选

为研究马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）衣壳蛋白（coat protein,CP）在体外表达及CP重组蛋白的晶体生长条件,通过Eco R Ⅰ/Hind Ⅲ酶切及连接技术构建pET-32a-PVY CP原核表达载体,对PVY CP的诱导剂浓度进行优化,利用蛋白质纯化及脱盐技术对PVY CP进行纯化和脱盐,并分析PVY CP重组蛋白的晶体生长条件。结果表明,成功构建了pET-32a-PVY CP原核表达载体;PVY CP在大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞BL21(DE3)原核表达系统中,于16℃下利用0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达可获得高浓度的PVY CP可溶性蛋白;PVY CP重组蛋白在二水甲酸镁处理下可生长出棒状结构晶体。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。