富有柿果ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以富有柿果为材料,用RNA提取试剂盒提取总RNA,根据已报道的柿果ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase,ACO)基因的序列设计并合成1对引物,通过RT-PCR方法获得1条约1.2 kb特异片段,把该片段连接到pGEM-T easy vector上进行测序,其全长共1 237 bp,编码区697 bp,共编码231个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与DK-ACO1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸的同源性达98%。     

富有柿果ACC合成酶基因RNA干扰植物表达载体的构建

分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。     

强雌性系西瓜ACC合成酶基因的克隆及其序列分析

为了解ACC合成酶基因对西瓜花性型分化的作用机理,根据已报道的西瓜ACC合成酶(ACS)基因序列,设计特异性引物,以强雌性西瓜总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到4条特异性片段:Cit-ACS1为1 690 bp、Cit-ACS2为402 bp、Cit-ACS3为598 bp和Cit-ACS4为499 bp.序列同...     

日本梨成熟果实中编码1-氨基环丙烷-1-羧化物（ACC）合成酶（PPACS3）的cDNA的克隆和其特征

植物激素乙烯调节很多生理过程，如种子发芽、果实成熟、脱落和衰老等。已有人详细地介绍过乙烯生物合成路径，在这条路径中，涉及ACC合成酶和ACC氧化酶两种酶。最近有人已从各种植物中分离到编码这两种酶的cDNA和基因组克隆。ACC合成酶和     

朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端序列的克隆及植物表达载体的构建

采用改良的RT-PCR及5′RACE法,成功地克隆了朝鲜碱茅甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA 5′端序列,与已知序列拼接,获得了BADHcDNA全长1781bp,包含一个完整的开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。其含有醛脱氢酶高度保守序列VT/SLELGGKSP,及其后29位与酶功能有关的Cys。多序列比对和系统进化分析表明,朝鲜碱茅BADH与大麦BBD1同源性最高,并构建了PBI121-BADH植物表达载体。     

香蕉ACC合成酶反义基因转化香蕉的研究

香蕉是重要的热带、亚热带地区作物,典型的呼吸跃变型果实,不耐贮藏.传统的保鲜方法存在诸多弊端,利用现代生物技术培育耐贮藏新品种,已经成为我们解决香蕉保鲜问题的重要课题.本研究利用果实特异性ACC合成酶基因反义植物表达载体,采用基因枪和农杆菌介导法转化海南主栽的巴西香蕉及红香蕉,并比较了不同转化方法及不同栽培品种的转化效果.结果表明农杆菌侵染法好于基因枪法,在农杆菌侵染方法中,对红香蕉的转化效果好于巴西香蕉.经PCR检测获得了9株转化植株,进一步采用Southern blot分析的方法,其中4株杂交信号较强,确认ACC合成酶反义基因已经整合进香蕉基因组中.本研究为香蕉的转基因研究和耐储藏新品种的培育奠定了一定的基础.     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

环境胁迫和激素诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三个成员的表达

ACC合成酶（ACS）是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。在克隆到甘蔗ACC合成酶基因家族3个成员Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3的基础上，分别以它们作为探针，检测了激素诱导和环境胁迫对甘蔗苗期该3成员表达的影响。结果表明，乙烯利诱导Sc-ACS1在叶中表达，在根中不表达；Sc-ACS2在根、叶中表达；Sc-ACS3主要在根部表达，在叶中不表达。在甘蔗叶片中，Sc-ACS1对冷胁迫、暗培养和LiCl胁迫均有应答，并受植物生长激素IAA诱导而表达；Sc-ACS2无论是在生长激素诱导还是环境胁迫下，其mRNA均维持较低水平。     

桃果实ACC氧化酶基因的克隆及序列分析

乙烯是调控果实成熟衰老的内源激素,有效地调控乙烯的生物合成便是控制果实成熟的关键,而ACC氧化酶是植物乙烯生物合成途径中的限速酶之一。本研究以成熟的白粉桃为材料提取果实总RNA,克隆ACC氧化酶基因,旨在利用反义技术抑制乙烯合成,延迟桃果实成熟,提高硬度。将克隆片段与pMD18-T载体连接并转化到E.coliDH5α,经PCR、酶切和测序鉴定。分析表明该基因全长为1246bp,其中编码区长960bp,共编码319个氨基酸,与已登陆的ACC氧化酶基因(AF319166)核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99%和98%,表明成功的克隆了ACC氧化酶基因。经生物信息学分析,推测该蛋白的分子式为C1626H2542N420O485S12,相对分子质量为36.12kDa,等电点为5.27;该蛋白为亲水性非分泌型蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主,是一个紧凑型球状结构域。     

小麦谷氨酰胺合成酶前体Ⅱ基因的克隆与分析

采用RACE方法,从小麦耐盐突变体RH8706-49的转录产物中获得谷氨酰胺合成酶Ⅱ(GS2)前体基因的全长cDNA序列,共包含1 690 bp,其中ORF区1 284 bp,编码427氨基酸。该基因已提交GenBank（登录号：DQ103756）。经Blast比对,该基因与大麦、水稻、玉米GS2的同源性分别达94.6%、87%和90.4%。经Northern Blottin     

高等植物ACC合成酶基因的克隆及其表达调控的研究进展

主要对高等植物ACC合成酶基因的克隆、结构及其表达调控等方面研究进展进行综述,旨在揭示ACC合成酶基因的分子特征,为运用基因工程技术探索控制果实成熟、软化和衰老的关键ACC合成酶基因,更进一步地通过转基因技术调控果实内乙烯的含量从而延长水果货架期提供思路。     

桃果实中ACC合酶基因克隆及基因沉默载体构建

摘 要：植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素。ACC合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默ACC合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生。本研究以中华寿桃为研究材料,采用RT-PCR 技术,克隆获得ACC合酶基因。将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5α,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定。测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99.6%,表明将ACC合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上。     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表达分析

通过对马蓝转录组数据分析,从马蓝叶片cDNA中克隆得到了色氨酸合成酶基因完整的编码序列(CDS),长度为807 bp,命名为BcTSA(GenBank登录号:MG857654),可编码269个氨基酸,并对其蛋白质理化性质、结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、编码蛋白的二、三级结构、亚细胞定位进行了分析。蛋白序列多重比对结果显示与其他植物的TSA蛋白序列具有一定的同源性,并通过qRT-PCR法检测BcTSA基因在不同器官的表达与外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)诱导表达情况。推测其编码的蛋白为亲水蛋白,相对分子质量为28.9 kD,理论等电点(pI)为5.65,无跨膜区;亚细胞定位分析结果显示,BcTSA定位在叶绿体中的可能性大,没有信号肽;有18个磷酸化位点,存在6个潜在的糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋构成;BcTSA氨基酸序列与其它15种物种氨基酸序列的保守区域达到81.35%的相似性;BcTSA基因在马蓝不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,根中最低;另外,发现BcTSA基因响应外源诱导子对代谢的调控。BcTSA基因的克隆与序列分析,有助于研究BcTSA基因的功能,对提高马蓝有效成分的含量具有重要意义。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

大白菜FAD8基因的克隆

脂肪酸去饱和酶基因FAD8是控制亚油酸向亚麻酸转换的关键酶,对植物的膜脂不饱和度有重要影响,关系到植物的抗寒能力,在拟南芥中是低温诱导表达的。根据已发表的FAD8序列,设计简并引物,从低温处理条件下大白菜叶片cDNA中克隆到一段200 bp的中间序列,进一步利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cD-NA ends,RACE),获得大白菜FAD8基因的5’和3’末端序列,经测序拼接获得1 509 bp的目的序列,编码432个氨基酸。与已经报导的油菜FAD8基因氨基酸序列同源性较高,达98%。杂交结果显示,该基因是单拷贝序列。这项工作为进一步研究叶绿体脂肪酸去饱和酶奠定了一定的基础。     

大青杨纤维素合酶PuCesA 7基因片段的克隆及序列分析

本研究以大青杨叶片总DNA为模板,用已登录的欧洲颤杨PtrCesA7保守序列设计引物,进行TD-PCR扩增并将得到的片段克隆到pMD18-T载体中。测序结果分析表明,片段长2341bp将该基因片段命名为PuCesA7。经BLASTX比对,此片段包含6个编码区,共1248bp,编码416个氨基酸。并与欧洲颤杨的PtrCesA7基因的同源性为98%,证明克隆的片段为纤维素合酶基因。将该片段与GenBank中登录的玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、欧洲颤杨(Populus tremuloides)、新西兰辐射松(Pinups radiata D.Don)同源纤维素合酶基因序列比对并进行进化树分析。结果表明,大青杨纤维素合酶基因片段均与它们的亲缘关系较远。