化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

 探索了离子霉素结合细胞松驰素B（cytochalasin B, CB）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）以及6-二甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine, 6-DMAP）等化学物质，对猪卵母细胞激活后发育的影响。试验1，体外成熟卵母细胞分别用15、20、25、30 mol·L-1的离子霉素处理40 min或电激活（1.3 kV·cm-1，80 s,1次脉冲），结果表明，20 mol·L-1组的激活率（69.93±5.80）%显著高于15 mol·L-1组（P <0.05），但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验2，卵母细胞采用20 mol·L-1离子霉素分别激活10、20、30、40、50 min，再用2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，其中，40 min组的卵裂率、囊胚率[（72.40±13.02）%、（25.37±11.43）%]较高，但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验3，卵母细胞经离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，分别用7.5 g·ml-1 CB、10 g·ml-1 CHX、2 mmol·L-1 6-DMAP、7.5 g·ml-1 CB +10 g·ml-1 CHX和7.5 g·ml-1 CB +2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，2 mmol·L-16-DMAP组的激活率、卵裂率和囊胚率[（86.05±4.29）%、（61.77±8.10）%和（21.62±3.31）%] 显著高于7.5 g·ml-1 CB组（P <0.05）与另外几组差异不显著（P >0.05）。试验4，卵母细胞由离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，用2 mmol·L-1 6-DMAP分别处理3.5、5.5、7.5 h，5.5 h组的卵裂率和囊胚率[(66.59±14.36)%和(25.40±10.16)%]高于另外两组，但差异不显著（P >0.05）。结果表明，离子霉素（20 mol·L-1、40 min）+6-DMAP（2 mmol·L-1 、5.5 h）为最佳激活方案。离子霉素激活卵母细胞后，CB与CHX、6-DMAP的互作对卵子的发育有抑制作用。     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率影响因素分析

 研究了月龄和卵巢采集后的保存条件对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响 ,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。试验包括 :(1)卵巢保存的生理盐水温度 (2 2、30、37、38.5、4 0℃ )对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。 (2 )卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟和后期发育的影响。 (3)初情期前后母猪卵母细胞对体外成熟和发育潜力的影响。结果表明 ,(1) 38.5℃保存的卵巢卵母细胞激活后的卵裂率 (79.6 4 % )和囊胚率(18.11% ) ,37℃的卵裂率 (76 .18% )和囊胚     

Effects of Ages of Donors and Conditions of Preserving Ovaries on Porcine Oocytes Maturation in vitro and Efficiency of Parthenogenetic Activation

Effects of different ages of donors and different conditions of preserving ovaries on porcine oocytes maturation in vitro and efficiency of parthenogenetic activation were studied. The experiments included: 1) effects of different temperatures (22, 30, 37, 38.5and 40℃) of preserving ovaries on porcine oocytes maturation in vitro and developmental potential; 2) effects of periods of preserving ovaries on porcine oocytes maturation in vitro and development in vitro; 3) effects of different ages of donors on porcine oocytes maturation in vitro and developmental potential. The results of the experiment showed:1) There were no statistical differences (p＞0.05) of the parthenogenetic cleavage rate (79.64% vs 76.18%) and blastocyst rate (18.11% vs 33.82%) between oocytes from ovaries preserved at 38.5℃ and those preserved at 37℃. When the preserving temperature was increased to 40℃, the cleavage rate (21.68%) and the blastocyst rate (0) were great significantly lower than those at 37℃(p＜0.01). The cleavage rate (80.79% vs 76.18%) and blastocyst rate (29.61% vs 33.82%) were not different between 30 and 37℃(p＞ 0.05). When the preserving temperature was decreased to 22℃, the rate of cleavage was not different,but the rate of blastocyst was significantly lower, compared with that at 37℃; 2) The cleavage and blastocyst rates of the porcine oocytes collected after slaughter 2 or 6h were not different (p＞0.05); 3) The cleavage rate of oocytes from gilts and sows after maturation was not different, but the blastocyst rate of the sow group was significantly higher than that of gilt group (p＜ 0.05). The blastocyst cell number of sows and gilt showed no difference (p＞0.05).     

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。     

利用电极盘进行猪卵母细胞电激活

[目的]研究不同电激活参数以及电脉冲联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活效果的影响。[方法]使用电极盘,测定不同场强（1．1、1．3、1．5、1．7、1．9kV／cm）,不同脉冲时程（30、50、70、90、110ps）,1次脉冲下猪卵母细胞囊胚率的变化。[结果]结果表明,脉冲强度以1．5和1．7kV／cm效果最好,在80胂时其猪卵母细胞囊胚率分别达到（22．35±5．16）％和（20．59±9．41）％;脉冲强度1．5kWcm,1次电脉冲后4h联合6-DMAP激活卵母细胞,当脉冲时程达到70和90μs时,囊胚率分别达到（21．65±9．95）％和（23．10±16．27）％。[结论]在试验条件下,使用电极盘的最适电激活参数为脉冲强度1．5-1．7kV／cm,脉冲时长80μs,1次脉冲电激活。     

影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素

卵母细胞是胚胎工程和发育生物学的重要组成部分，它是体外受精、性别控制、克隆及转基因等技术成功与否的前提和关键。影响猪卵母细胞体外成熟的因素很多，本文将从物理因素和化学因素两方面作简要综述。     

绵羊卵母细胞孤雌激活及其随后体外发育的初步研究

对绵羊卵母细胞体外成熟培养和孤雌激活的影响因素作了初步研究.卵母细胞在TCM199培养液中培养24 h后,采用1.3 kV/cm、60 μs、0.1 mmol Ca2+和1.4 kV/cm、40 μs、0.1 mmol Ca2+2种处理对成熟卵母细胞进行电激活,卵裂率分别为76.1%和77.0%,2种处理差异不显著(P＞0.05).发生卵裂的卵母细胞在SOFaaBSA培养液中培养(分换液和不换液2种处理)至7～8 d统计囊胚率,换液的囊胚率为12.2%,不换液的囊胚率为22.8%,二者差异显著(P＜0.05).     

猪卵母细胞孤雌激活的研究

从卵母细胞孤雌激活的机制及影响因素,猪卵母细胞的激活,猪孤雌胚死亡主要原因,提高卵母细胞孤雌激活效果的技术途径,以及对孤雌激活的研究意义和发展前景等方面,对猪卵母细胞孤雌激活研究进行了综述.     

猪卵母细胞体外成熟研究

[目的]探讨猪卵母细胞体外成熟的最佳培养条件。[方法]以NCSU-23为基础培养基,研究不同激素组合和培养时间（36、40、44和48 h）对猪卵母细胞体外成熟的影响。[结果]猪卵母细胞体外培养44 h后,成熟率最高,为81.4%;猪卵母细胞在成熟培养液培养22h后,再在无激素培养液中继续培养22 h时,成熟率最高;添加性腺激素的组成熟率显著高于不添加组,差异显著（P〈0.05）。[结论]在体外成熟培养过程中,添加性腺激素能显著提高猪卵母细胞成熟率。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究

目的:探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法,为兔体细胞核移植提供实验基础。方法:兔超排后获得卵母细胞体外成熟22~24 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养5~7 d,观察胚胎发育与囊胚形成情况。结果:卵母细胞经过离子霉素作用5 min或者乙醇作用7 min均能被激活,但两者卵裂率、囊胚率都较低;乙醇和离子霉素分别与6-DMAP联合激活兔卵母细胞时,离子霉素+6-DMAP处理组卵裂率(73.7%)显著高于乙醇+6-DMAP处理组(38.5%,P<0.05);与离子霉素联合激活时,2.0 mmol/L的6-DMAP处理5.0 h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。结论:激活方法对兔卵母细胞孤雌激活率的影响很大,不同激活剂的联合应用及激活剂的作用时间对兔卵母细胞的激活存在显著差异。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及卵裂的影响

研究了生长激素(STH)、胰岛素(insulin)单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:STH、胰岛素对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂呈现双重效应。在mNCSU-23基础液中添加0.15μg/mLSTH组的成熟率和卵裂率显著高于对照组及0.01,0.05,0.1,2μg/mL组(P<0.05);添加5μg/mL,8μg/mL胰岛素组的成熟率显著高于对照组及0.5,2,10μg/mL组;添加5μg/mL胰岛素组的卵裂率也显著高于对照组及0.5,2,8,10μg/mL组;0.15μg/mLSTH与2μg/mL胰岛素联合添加组的成熟率和卵裂率最高,同其他组相比,差异显著。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液(含FSH)中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子(EGF),24h后检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明:添加10ng/ml、30ng/mlEGF组牛卵母细胞成熟率较对照组(未添加EGF)无显著差异(79.8%vs71.5%vs70.4%,p>0.05),但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%(P<0.01);在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml、50ng/mlEGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率(P>0.05),但可显著提高其囊胚孵化率(P<0.01)。     

减少细胞质对激活小鼠卵母细胞体外发育的影响

 以溶液的表面张力为主要动力 ,辅以显微操作法去除一定量的卵母细胞胞质。测量了去除的细胞质体的直径 ,第一组为 38.6 4 μm ,第二组为 6 1.5 2 μm。小鼠卵母细胞的平均直径为 80 μm ,则第一组细胞质体占卵母细胞体积的 11.3% ,第二组细胞质体占卵母细胞体积的 4 5 .5 %。去除细胞质后两组卵母细胞均被氯化锶激活 ,其培养后卵裂率没有显著差异 (80 .0 %vs 77.9% ) ,两者都显著低于未经去质处理的激活卵母细胞和受精卵的卵裂率。两者的囊胚发育率虽没有显著差异 (37.3%vs 36 .8% ) ,但均显著低于未经去质处理的激活卵母细胞和受精卵的囊胚发育率 (4 8.3%和 73.3% )。去除 11.3%和 4 5 .5 %细胞质的卵母细胞孤雌激活胚、未经去质处理的激活卵母细胞和受精卵 ,体外培养的囊胚细胞数 (17.2 8± 7.16 ,11.5 0± 6 .83,2 1.86± 7.5 2 ,4 4 .6 7± 6 .86 ) ,各组间差异显著。     

山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育的研究

用离子霉素、乙醇、电刺激和Ca-A23187对体外成熟山羊卵泡卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚体外发育进行了较为系统的研究。结果表明:2.5,5.0,10.0μmol/L离子霉素对卵母细胞激活率分别为54.0%,58.2%,57.9%,孤雌胚发育率分别为1.5%,3.4%,0%,激活率和发育率均无显著差异(P>0.05)。5.0,10.0,15.0,20.0μmol/L Ca-A23187对卵母细胞激活率分别为31.0%,46.4%,41.8%,45.8%,其中5.0μmol/L Ca-A23187激活率显著低于其他处理组(P<0.05)。5.0μmol/L处理大于4-细胞发育率,极显著低于10.0μmol/L和20.0μmol/L处理(P<0.01),显著低于15.0μmol/L处理(P<0.05)。3%,7%,11%和15%乙醇对卵母细胞激活率分别为40.0%、61.4%、63.0%和67.9%,其中3%乙醇活化率极显著低于其他各组(P<0.01)。15%乙醇致卵母细胞死亡率为15.4%,显著高于其他各组(P<0.05)。7%和11%乙醇处理2~4-细胞和大于4-细胞的发育率,均显著高于3%和15%乙醇处理(P<0.05)。15%乙醇处理大于8-细胞的发育率,极显著低于7%乙醇(P<0.01),显著低于11%乙醇(P<0.05)。在含Ca2 电激液中,用1.00,1.25,1.50,1.80 kV/cm电压刺激卵母细胞,活化率分别为48.4%,54.3%,55.8%,45.1%,2~4细胞卵裂率分别为52.3%,57.9%,54.7%,53.1%,差异均不显著(P<0.05)。     

猪裸卵体外胞质成熟研究

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1 053.67)与COC组(1 426.00)和COC+GC组(1 541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著(P0.05);成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。     

IGF-I、TGF-α、bFGF对猪卵母细胞体外成熟和卵裂的影响

 研究了IGF-I、bFGF、TGF-α 3种细胞因子单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后卵裂的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明，3种细胞因子对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应（1）20 ng·ml-1的IGF-I的成熟率和卵裂率显著的高于对照组和10、30、40、50、100 ng·ml-1组[（85.3 ±2.11) %，（85.4±2.81）%；（71.1 ±1.91）%，（62.5 ±0.98）%；（77.5 ±2.5）%，（59.1 ±3.93）%；（61.9 ±1.72）%，（54.3 ±3.48）%；（58.6 ±4.26）%，（53.1 ±1.23）%；（44.4 ±5.10）%，（49.8 ±3.55）%；（33.9 ±3.48）%，（46.1 ±3.59）%，P <0.05)，当IGF-I的浓度达到100 ng·ml-1时,成熟率（33.9±3.48）%和卵裂率（46.1±3.59）% 降低，与其它各组相比差异显著（P < 0. 05）。（2）20 ng·ml-1的bFGF的成熟率（85.0 ±1.70）%和卵裂率（85.0±2.82）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（3）15 ng·ml-1的TGF-α的成熟率（86.9±0.46）%和卵裂率（86.3±2.01）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（4）15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1bFGF联用组，卵母细胞成熟率和分裂率显著高于20 ng·ml-1 bFGF和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；与20 ng·ml-1 bFGF、20 ng·ml-1 IGF-I和15 ng·ml-1 TGF-α三者联用组。[（89.2±1.44）%和（88.8±0.17）%.（75.6±0.98）%和（78.3±1.65）%；（77.2±2.54）%和（80.2±2.26）%；（76.4±1.28）%和（77.4±3.73）%，P <0.05]。     

不同激活方法对猪ICSI卵早期发育的影响

[目的]探讨不同激活方法对猪单精子显微受精（ICSI）胚发育的影响。[方法]冷冻精子解冻洗涤后直接应用于ICSI,ICSI后采用不同激活方法激活卵母细胞,检测其原核形成情况。[结果]结果表明,单纯电脉冲激活以及电脉冲与6-DMAP联合激活其受精率分别达53.3%和60.4%,对ICSI卵雌雄原核形成的影响差异不显著（P〉0.05）;ICSI后采用不同激活方法激活卵母细胞,检测猪ICSI卵胚胎早期发育情况,单纯电脉冲激活囊胚率达13.0%,显著高于对照（P〈0.05）。[结论]单纯电脉冲激活能促进猪ICSI胚胎的早期发育。     

猪裸卵体外胞质成熟研究(英文)

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1053.67)与COC组(1426.00)和COC+GC组(1541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P<0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P<0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%)(P<0.05),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著;成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P<0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。     

猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养

 主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系。用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞。结果表明 ,在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 130V·mm-1/ 80 μs ,其囊胚发育率为 (2 0 .12± 8.18) % (P >0 .0 5 )。多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 (P >0 .0 5 )。孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 7d ,发现 7d不换液与第 5天换液和第 5天换含 10 %胎牛血清的培养液其囊胚发育率 [分别为 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、(2 6 .4 4± 8.35 ) %和 (17.6 8± 5 .39) % ]无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,后两者换液培养方式其囊胚细胞数 (15 .78± 5 .4 6、14 .5 5± 4 .81)明显低于不换液的 (18.0 1± 6 .79,P <0 .0 1)。同时发现低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 (5 %CO2 的空气 )无明显差别 ,分别为 [(2 0 .78± 8.80 ) %、17.0 0± 6 .12和 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、18.0 1± 6 .79,P >0 .0 5 ]。表明激活后第 5天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数。低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 (5 %CO2 的空气 )好。