甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因全克隆及工程载体的构建

蔗糖磷酸合成酶在甜瓜果实蔗糖合成途径中起关键性的调节作用,克隆该基因并导入甜瓜低糖自交系,可改良甜瓜果实品质创新优良种质。从甜瓜幼苗叶片提取总RNA,利用RT-PCR与Southern blot方法相结合,重组子质粒经限制性内切酶酶切和PCR验证以及测序同源性比较,克隆到基因的5’(2859bp)和3’(852bp)。应用高保真Taq聚合酶PCR拼接蔗糖磷酸合成酶完整cDNA序列3692bp,该片段与GenBank中其它植物基因序列具有97%￣99%的同源性,登录号DQ364058。应用BamHⅠ、KpnⅠ、BglⅡ限制性酶切获得植物双元表达载体pROK2及基因的线性片段,通过T4连接酶反应,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的工程载体pROK-SPS,该载体含有Npt-II选择标记基因。     

甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

 根据在GenBank中登录的番茄、胡萝卜和柑桔等酸性转化酶基因的保守序列设计引物，采用RT-PCR方法，从甜瓜果实总RNA中扩增出目标cDNA片段，克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明，它与其它植物的酸性转化酶基因的同源性很高，与番茄氨基酸序列同源性为99％，说明已经成功克隆到甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段，在GenBank中登记号AF490425。     

草莓果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分析

 为了分析草莓（Fragaria × ananassa Duch.）果实发育过程中可溶性糖积累与相关基因表达量的关系,以‘杜克拉’草莓7个发育时期的果实为试材,利用实时荧光定量RT-PCR的方法,分析果实发育中蔗糖转运蛋白及糖代谢关键酶（酸性转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶）4个基因的表达量以及可溶性糖含量的变化趋势。结果表明,蔗糖、葡萄糖和果糖含量随着果实发育都呈逐渐增加的趋势,尤其蔗糖积累与果实成熟的关系较密切。随着果实发育,蔗糖磷酸合成酶基因表达量呈逐渐增加的趋势,尤其在果实发育的后期增加较快;蔗糖合成酶和酸性转化酶基因表达量除了白熟期和转色期外,呈逐渐降低的趋势;蔗糖转运蛋白基因表达量呈先升后降,降后又升的变化趋势,尤其在白熟期前急剧增加。结合可溶性糖和基因变化趋势分析表明,蔗糖转运蛋白和蔗糖磷酸合成酶在草莓果实发育过程中发挥着重要的作用。     

不同肉色薄皮甜瓜糖积累变化规律

以黑龙江八一农垦大学农学院甜瓜育种课题组自行培育的黄肉H86、清白肉Q94、白肉B99、橘黄肉J149和绿色肉L168这不同肉色自交系品种为试材,测定了不同发育时期果实中的蔗糖、葡萄糖、果糖含量以及蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、酸性转化酶(AI)及中性转化酶(NI)等糖代谢相关酶的活性变化,并对甜瓜果实糖积累的生理机制进行了系统分析。结果表明:H86果实蔗糖合成酶活性与蔗糖积累量紧密相关,30d蔗糖含量到达峰值,属蔗糖积累型;Q94果实内高水平的酸性转化酶活性对葡萄糖、果糖积累以及促进果实形态的构建有着重要意义,属还原糖积累类型;B99整个发育期蔗糖合成酶活性、蔗糖磷酸合成酶活性、酸性转化酶活性和中性转化酶活性一直保持较高水平,在花后25d活性均处于首位,属蔗糖积累类型;B99幼果期葡萄糖含量较高,蔗糖积累量在果实整个的生长发育期内都保持上升趋势直至成熟,果糖积累量与蔗糖合成酶活性及中性转化酶活性相关,该自交系品种属于蔗糖积累类型;J149果实内葡萄糖和果糖均在花后25d时开始积累直至成熟,成熟时葡萄糖含量居于首位,果糖合成升高与中性转化酶活性上升有关,属还原性糖积累型;L168成熟果实内蔗糖含量居于首位,果实内酸性转化酶活性和中性转化酶活性的变化对甜瓜果实品质形成有着重要的意义,属于蔗糖积累型。     

嫁接对网纹甜瓜果实发育、糖含量及蔗糖代谢相关酶活性的影响

 试验研究了嫁接对日光温室栽培的网纹甜瓜果实发育、糖含量及蔗糖代谢相关酶活性的影响。结果表明: 嫁接加快了果实的膨大速度, 但对中果肉厚度影响不大; 降低了网纹甜瓜中果肉内的果糖、葡萄糖含量; 改变了网纹甜瓜蔗糖积累模式, 嫁接网纹甜瓜中果肉内蔗糖积累时间较自根提前了7 d左右,蔗糖含量高于自根; 但嫁接降低了网纹甜瓜中果肉的总糖含量及酸性转化酶(AI) 和中性转化酶(NI) 活性, 提高了蔗糖磷酸合成酶( SPS) 和蔗糖合成酶( SS) 活性。     

硝酸钙对嫁接网纹甜瓜果实糖含量及糖代谢相关酶活性的影响

为解决嫁接厚皮甜瓜含糖量下降的问题,以自根厚皮甜瓜和嫁接厚皮甜瓜为试材,探讨了不同浓度硝酸钙处理对嫁接厚皮甜瓜糖代谢的影响。结果显示：叶面喷施不同浓度硝酸钙对嫁接厚皮甜瓜果实糖含量的影响程度不同。与嫁接对照相比,0.5 %硝酸钙处理显著增加了嫁接厚皮甜瓜果实发育后期（处理后14～42 d）的果糖、葡萄糖、蔗糖含量,降低了棉籽糖和水苏糖含量,提高了肌醇半乳糖含量|0.2 %和0.8 %硝酸钙处理虽也在一定程度上影响着可溶性糖含量,但影响程度低于0.5 %硝酸钙处理|处理21 d后,3个浓度的硝酸钙处理均极显著增加了果实中总糖含量,且0.5 %硝酸钙处理还极显著增加了淀粉含量|但与自根对照相比,0.5 %硝酸钙处理的果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉和总糖含量仍未能增加至自根厚皮甜瓜水平。从果实的蔗糖代谢及半乳糖代谢相关酶来看,与嫁接对照相比,叶面喷施不同浓度的硝酸钙处理均显著或极显著的增加果实发育中期（处理后14～28 d）酸性转化酶、碱性α- 半乳糖苷酶和果实发育中后期（处理后28～42 d）蔗糖磷酸合成酶的活性,但对于中性转化酶和蔗糖合成酶活性影响不显著|与自根对照相比,0.5 %硝酸钙处理的酸性转化酶活性未达到自根对照水平,蔗糖磷酸合成酶活性大幅提升,与自根对照差异不显著。结果表明：与嫁接对照相比,叶面喷施不同浓度硝酸钙处理均可不同程度提高嫁接厚皮甜瓜果实淀粉、总糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量及其果实发育前中期的酸性转化酶、碱性α- 半乳糖苷酶和果实发育中后期的蔗糖磷酸合成酶等糖代谢相关酶活性,其中0.5 %硝酸钙处理效果最佳,增加了果实发育中后期蔗糖含量,具有改善嫁接厚皮甜瓜果实品质的作用。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

甜瓜果实蔗糖代谢酶提取液中2种去糖方法的比较

以甜瓜鲁厚甜1号开花当天的果实为试材,分别测定蔗糖代谢相关酶—酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性。对酶提取液中干扰测定结果的可溶性糖采取2种方法进行去除(1)直接用SephadexG-25柱离心去糖;(2)酶提取液先经过硫酸铵沉淀,去糖,重新溶解后再用SephadexG-25柱脱盐。结果显示,方法2处理后AI和NI、SPS和SS的活性均高于方法1。这表明在研究甜瓜果实蔗糖代谢相关酶活性时,采用方法2处理酶提取液效果更好。     

‘南果梨’果实发育过程中糖分积累与相关基因表达分析

【目的】探讨‘南果梨’果实发育过程中糖分变化与糖代谢相关基因表达之间的关系。【方法】以‘南果梨’不同发育时期的果实为试材,测定了其中果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖的含量并分析了与糖代谢相关基因的表达。【结果】在果实幼果期山梨醇为主要糖,而在中后期则为果糖。蔗糖合成酶Pu SS1在花后60 d表达量最大,而Pu SS2在花后60、120及134 d表达量相对较高;蔗糖磷酸合成酶Pu SPS1在花后120 d的表达量最大,而Pu SPS2在花后60 d表达量最大;蔗糖转运蛋白Pu SUT及β-葡萄糖甘酶Pu BGLU1、Pu BGLU2和Pu BGLU4在果实发育的早期大量表达;碱性/中性转化酶Pu NINV1和Pu NINV2在花后134 d大量表达。【结论】各糖分在果实发育过程中变化规律不同,可能与糖代谢相关基因的差异表达有关。     

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

不同授粉方式对设施厚皮甜瓜果实品质的影响

比较了蜜蜂授粉、人工授粉及氯吡脲喷花对设施厚皮甜瓜果实品质的影响。结果表明：蜜蜂授粉、氯吡脲喷花与人工授粉相比,可以显著提高厚皮甜瓜的单瓜质量、果实纵径、横径、果肉厚以及果实中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量。但是,采用氯吡脲喷花显著降低了种子中可溶性糖含量及千粒重,明显减少了果实中风味物质的种类和含量。氯吡脲喷花后 30 d果实中的氯吡脲残留量仅为 0.62 μg · kg^-1,残留量在安全范围之内。因此,采用蜜蜂授粉可以显著改善果实品质,是设施甜瓜实现安全、优质、高效生产的重要配套技术之一。     

越瓜果实发育过程中糖的变化与相关酶活性的关系

以从各地搜集的6 个越瓜品种为试材,对越瓜果实糖含量及蔗糖代谢相关酶进行了研究。结果表明：不同越瓜品种之间糖含量差异较大,凤台越瓜、田集越瓜、刘集越瓜3 个品种可溶性固形物含量及糖含量较高;随着果实的发育蔗糖磷酸合成酶活性呈递增趋势,且在果实各个发育期田集越瓜的蔗糖磷酸合成酶活性均最高;而转化酶活性则随着果实发育呈下降趋势,凤台越瓜和田集越瓜的酸性转化酶及中性转化酶活性在各个发育期均最低;中性转化酶在毛集越瓜、潘集越瓜、青皮越瓜、刘集越瓜中相对较高,且随着果实发育活性下降,至果实成熟时活性达到最小值;除刘集越瓜外,其他品种的蔗糖代谢酶活性在果实不同发育期均没有明显变化。以上结果表明,不同越瓜品种蔗糖含量差异是由蔗糖磷酸合成酶、酸性转化酶和中性转化酶活性共同决定的,其中酸性转化酶在越瓜蔗糖积累中占主导地位。     

甜瓜胚抢救最佳时间的确定

取辐射花粉授粉后7～14天的WT-1甜瓜幼果,将其横切成10～18片,观察其种胚的发育状况.结果发现,授粉后7天的甜瓜果实中大多数的种胚尚未完全形成;授粉后17天的甜瓜果实中可抢救的胚的数量低于20%,绝大多数种子已成空壳;而以授粉后12天左右的甜瓜果实中可抢救的胚的数量较高.     

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。     

‘巨峰’葡萄盛花后弱光胁迫对叶片光合生理及光合酶基因表达的影响

为了探明弱光胁迫对葡萄叶片光合生理的影响,以4年生‘巨峰’葡萄为材料,在盛花后进行20 d 70%遮光作为弱光处理,然后恢复至未遮光植株(对照)水平,测定果实品质和叶片的光合参数、叶绿素荧光、叶绿素含量、叶片糖含量及组分、光合酶基因及蔗糖磷酸合成酶基因表达等。结果发现,弱光处理导致成熟期葡萄果实可溶性固形物含量降低,可滴定酸含量升高,果皮花色苷含量减少,果实纵径降低。随着弱光时间延长,叶片叶绿素b含量增加,叶绿素a/b值下降,光合速率和光化学效率降低,叶片中可溶性糖含量降低,Rubisco大、小亚基,PRKase,SPS1-2,SPS3等基因表达受到抑制;光照恢复至对照水平10 d后,光合速率、光化学效率及可溶性糖含量略有上升,光合酶基因表达得到部分恢复;恢复光照50 d后,叶绿素a/b、叶片可溶性糖含量、部分光合酶基因和SPS表达等基本与对照水平一致,仅Rubisco大亚基1(RbcL1)表达仍低于对照。说明长时间弱光处理对葡萄叶片光合中心的损伤短期内不可逆,部分光合酶和蔗糖代谢关键酶基因表达受到抑制,叶片光合能力下降,光合产物合成与积累减少,进而导致了葡萄果实变小,品质降低。     

Sucrose metabolism in watermelon fruit is affected by fruit-setting method under plastic film greenhouses

Fruit set represents the very first step of fruit development. This study investigated the effect of different fruit-setting methods [1-(2-chloro-4-pyridyl)-3-phenylurea (CPPU) treatment, artificial pollination, and honey bee pollination] on the concentrations of fructose, glucose, and sucrose, and the activities of sucrose metabolising enzymes of watermelon fruit under plastic film greenhouse conditions. No significant difference in fructose and glucose concentrations was observed among the three treatments at fully ripe stage of fruit [33 days after anthesis (33 DAA)]. However, artificial and honey bee pollination significantly increased sucrose concentration. Measurement of sucrose metabolising enzyme activities and correlation analysis demonstrated that the increased activity of SuSy-s (sucrose synthase, synthesis direction) is the key mechanism of increased sucrose concentration in the artificially pollinated and honey bee pollinated fruits. The concentrations of fructose, glucose, and sucrose were similar between artificially pollinated and honey bee-pollinated fruits at fully ripe stage (33 DAA). Therefore, we can conclude that artificial and bee pollination can improve the sweetness of watermelon fruit. In addition, the honey bee can provide a pollination service that is similar to that of artificial pollination for watermelon grown in a protected cultivation system.