鸡胚体外培养影响因素的研究

以种鸡蛋为实验材料 ,分别在孵化 0、3和 6d后 ,抽取 1mL蛋清 ,用石蜡或自配封口胶封闭针孔 ,以探索抽蛋清和不同封口方法对不同日龄鸡胚发育的影响。实验结果表明 ,抽取蛋清对 3日龄鸡胚的发育和孵出的影响较小 (P <0 .0 1) ,孵化率达 76 .3% ,而对 0日龄、6日龄鸡胚发育和孵出的影响较大 ,孵化率只有 30 .6 %和 4 1.2 %。与石蜡封口相比 ,自配封口胶封口组的鸡胚孵化率明显提高 (P <0 .0 1) ,自配封口胶封口组的鸡胚孵化率为 76 .3% ,石蜡封口组的鸡胚孵化率只有 2 1.4 %。     

鸡胚原壳体外培养研究

以种蛋原壳为鸡胚体外培养的孵化蛋壳,就开孔位置、开孔大小以及鸡胚胚龄对鸡胚体外培养效果的影响进行了研究。结果表明:(1)小头侧面开孔明显优于小头顶端开孔(P<0.01),小头侧面开孔的已孵化3 d鸡胚的孵化率为80.0%,而小头顶端开孔的则只有60.0%;(2)随着开孔直径的增加,鸡胚孵化率呈下降趋势,开孔直径为0.5,1.0和1.5 cm时的孵化率分别为80.0%,30.0%和16.7%;(3)在小头侧面开孔且孔直径为0.5cm时,X期鸡胚和已孵化3 d鸡胚的体外培养孵化率差异达极显著水平(P<0.01),已孵化3 d鸡胚的体外培养孵化率为80.0%,X期鸡胚的孵化率则为0。     

鸡胚盲肠上皮细胞体外培养纯化方法的研究

为探讨鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的纯化方法,采用低速离心去除单细胞、差速贴壁去除成纤维细胞纯化上皮细胞,并对培养细胞的纯度进行了测定。结果表明:采用1200r.min-1 5min的离心条件,利用贴壁差细胞种植1.5h后倒瓶的方法可去除部分单细胞和大部分纤维细胞,细胞种植第3天～第11天纯度可达72.00%以上。提示低速离心结合差速贴壁法可达到纯化盲肠上皮细胞的目的,可为试验研究提供较为理想的细胞模型。     

鸡胚大头开孔原壳体外培养方法的建立

通过原壳体外培养和抽蛋清的方法，研究了胚龄、蛋清抽取量对鸡胚发育的影响。结果表明：X期鸡胚抽取1mL、3mL和6mL蛋清后，其孵化率分别为38．6％、30．35％和8．6％。抽取蛋清1mL组（P〈0．01）和3mL组种蛋（P〈0．05）的孵化率明显优于抽取6mL组。对、3日龄鸡胚，抽取9mL蛋清后，鸡胚发育受到的影响最大，其孵化率仅为33．3％，明显低于3mL和6mL组（P〈0．01）；而抽取3mL和6mL蛋清对3日龄鸡胚的影响较小，其孵化率仍高达74．3％和76．5％。抽取6mL蛋清并在大头顶端开直径为110cm的圆孔进行鸡胚原壳体外培养获得成功，3日龄鸡胚的孵化率为18．5％。     

空气对X期鸡胚原壳发育的影响

通过抽蛋清、延长空气与胚胎接触时间的方法,就空气对X期鸡胚原壳发育的影响进行了研究.种蛋开孔0.5 cm,用蛋壳皿立即封口后进行孵化,X期鸡胚和3日龄鸡胚的孵化率呈现出极显著的差异(P＜0.01),X期鸡胚的孵化率为0,而3日龄鸡胚的孵化率高达80.0%.种蛋抽取1.0 mL蛋清后,X期鸡胚和3日龄鸡胚的孵化率也呈现出极显著的差异(P＜0.01),X期鸡胚的孵化率为31.3%,3日龄鸡胚的孵化率为81.3%.开孔后在空气中暴露2 h,然后封口孵化,结果孵化鸡胚的死亡明显加快(P＜0.01),7日龄鸡胚的存活率立即封口组为51.6%,2 h后封口组为25%.上述实验表明,开孔与空气接触、抽蛋清使蛋内进入空气或延长空气与X期鸡胚接触的时间都可使鸡胚在孵化过程中的死亡加快,从鸡胚死亡的幅度来看,空气可能是影响鸡胚体外培养的最重要因素.     

不同时期鸡胚体外培养及其影响因素的研究

采用代用蛋壳体外培养方法，对不同时期鸡胚胎换蛋壳培养进行了研究。结果表明：体外受精卵体外培养发育率为10％。X期胚胎体外培养的出雏率为1.2%；孵化1日龄胚胎体外培养的出雏率为7.9%；去1／4壳的鸡胚出雏率为3.7%；鸡胚胎换蛋壳以后，添加6－8mL稀蛋白对换壳鸡胚发育比较适宜。     

鸡胚胎体外培养的研究

鸡胚体外培养系统包括：将鸡胚从蛋壳中取出转入代用蛋壳I中补加蛋清至满,用保鲜膜封口固定,38℃、翻蛋角90。、RH4096孵化72h。然后转入代用蛋壳Ⅱ中用保鲜膜封口固定,38℃、翻蛋角40。、RHS0％孵化至i8d,之后转入恒温箱停止翻蛋在37．5℃、RH60％的条件下孵化至出雏。通过以上培养系统,在手工翻蛋(4次／d)的情况下分两组处理17只鸡胚,孵化率为11．8％(2／17),两只雏鸡中一只为弱雏;在自动翻蛋(1次／h)的情况下处理40只鸡胚,孵化率为22．5％(9／40)。孵出的小鸡经正常饲养能够长大并产卵。通过自动翻蛋体外培养系统可以获得满意的效果。实验过程中发现,两次转移对胚胎和卵黄造成的损伤、卵黄膜与代用蛋壳的粘连、培养过程中细菌的污染和翻蛋角度是影响孵化率的重要因素。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存与体外培养研究

利用Ficoll密度梯度离心,提取鸡胚第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),用不同的冷冻保护液,对PGCs采用分离后直接冷冻保存和体外培养24h后冷冻保存2种方法,以筛选合适的冷冻保护体系。结果发现,分离提纯后直接进行冷冻保存的PGCs,存活率最高为(87.07±1.29)%;体外培养24h后进行冷冻的PGCs,存活率最高为(44.08±1.19)%。对复苏后的PGCs进行体外培养结果发现,分离提纯后直接进行冷冻的PGCs,在体外培养过程中具有形成细胞克隆的能力,且可传代和进行体外分化;而体外培养24h后进行冷冻的PGCs,复苏后在体外培养过程中不能形成细胞克隆,且在体外培养40h左右死亡。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的分离培养

[目的]进一步优化生殖细胞（PGCs）细胞体外培养条件。[方法]从第28期（5．5d）鸡胚生殖嵴分离PGCs,将PGCs与性腺基质细胞共培养进行原代培养,比较2种培养温度和3种培养浓度对PGCs原代培养的影响,以及2种饲养层细胞对PGCs传代培养的影响,并通过倒置显微镜下形态学观察、碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸希夫反应（PAS）染色方法鉴定PGCs。[结果]培养浓度为2．5×10^5个／ml和培养温度为37℃时PGCs增殖较多,不易分化,存活能力较强,以第2代鸡胚成纤维细胞作饲养层时传代培养效果较好,获得了PGCs增殖的未分化集落,为后期的细胞标记及移植研究提供了较多数量和较高活力的PGCs。[结论]获得了PGCs原代与传代培养较好的培芥体系,为禽类EG细胞系的建立和转基因研究奠定了基础。     

山羊半胚体外培养试验

研究了培养基、血清浓度和培养温度对山羊半胚体外发育的影响。结果表明:与杜氏磷酸缓冲液和TCM—199相比,在改良Whitten氏液中进行体外培养可显著提高半胚体外发育率(P<0.05);用改良Whitten氏液进行体外培养,含10％和15％犊牛血清组的半胚发育率显著高于5％血清组(P<0.05),极显著地高于无犊牛血清组(P<0.01);在38～39℃的条件下培养半胚的效果显著优于36℃(P<0.05),但在37～39℃的范围内,温度对半胚体外发育率无显著影响(P>0.05)。     

百合幼胚离体培养的研究

对百合败育胚离体培养的影响因素进行研究的结果表明：pH值对百合幼胚的萌发及成苗有一定的影响，以pH值5.0为最好；活性炭的浓度对其影响不明显，培养基中加入氨基酸类物质使胚萌发及成苗比率均高于对照，加入维生素类物质对胚的影响不大。     

百合幼胚离体培养基的筛选

以切花百合品种间杂交获得的胚龄为30～50d的幼胚作为外植体 ,进行离体培养基的筛选。结果表明 :基本培养基对萌发率、成苗率、生长势的影响从好到差顺序为MS>N6>SH>LS>Monnier>DCR>改良White;碳源种类对萌发的影响从好到差顺序蔗糖、甘露醇、白糖、葡萄糖、果糖 ,胚的成活情况与渗透压密切相关 ;生长素(NAA)不同浓度对幼胚成活的影响从好到差顺序为0.001>0.01>0.1>1>0,细胞分裂素(6-BA)不同浓度对幼胚成活的影响从好到差顺序为0.001>0.01>0.1>1>0。采用正交试验设计对幼胚萌发率及生长情况进行分析得出最优组合培养基为:糖60g·L-1+6 -BA0.1mg·L-1+NAA0.001mg·L-1+CH和VB6,基本培养基为MS附加琼脂10g·L-1,pH值为5.0的培养基     

荔枝幼胚的离体培养

把3个不同胚胎发育类型荔枝(Litchi chinensis Sonn.)品种乌叶、兰竹、绿荷包的幼胚置于含有不同生长调节剂的MS培养基上进行培养。结果表明:授粉后15d的胚胎人工培养十分困难,而授粉后30-40d的幼胚,在MS基本培养基附加一定浓度的BA,NAA,GA以及ABA等的不同组合培养基上,均可诱导形成细胞团,并能进一步形成胚状体或芽状体,部分败育型品种兰竹,在胚胎败育早期但未死亡的幼胚,以及完全败育型品种绿荷包,在授粉后30d的胚珠,经培养亦能形成胚状体,胚状体在MS或1/2MS附加低浓度的细胞分裂素及生长素等的培养基上,增殖能力甚强,甚至不加任何附加物的情况下亦能增殖。高浓度的附加物则不利于胚状体的增殖。从胚状体诱导成苗有待进一步研究。     

利用正交法研究丁香幼胚离体培养的影响因素

利用正交法研究5种不同因素(糖、胚龄、Gln、BA、NAA)对丁香幼胚萌发及成苗的影响,筛选出最佳的幼胚离体培养条件为在Monnier+0.1mg·L-1BA+0.001mg·L-1NAA+400mg·L-1Gln+50g·L-1糖培养基上培养胚龄为50d的丁香幼胚,同时发现Gln的加入量对丁香幼胚离体培养的萌发率有显著影响。     

栾树离体幼胚成苗技术研究

通过栾树离体幼胚可以产生愈伤组织和再生植株。外植体消毒时,最适宜的方法是先去种皮再消毒,消毒时间酒精处理30 s,升汞处理9 min;用1 mg·L-1的GA3对外植体进行预处理,可以促进幼胚的无菌萌发;6BA有利于幼胚的快速成苗,最佳激素浓度为2 mg·L-1,2,4D有利于产生愈伤组织,最佳激素浓度为2 mg·L-1,5 mg·L-1的6BA与2,4D易导致外植体褐化、坏死;在使用AC时,要考虑到AC的无选择吸附性,应加大使用附加物的浓度或降低AC的使用量。     

苹果三倍体成熟胚的离体培养研究

以苹果三倍体乔纳金成熟胚为材料,在含不同激素或添加物的培养基上进行萌发出苗培养,结果表明:F14+活性炭1.0g/L+水解乳蛋白400mg/L+抗坏血酸100mg/L为最适宜培养基;光照培养比黑暗培养好;培养基中添加0.5mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA能有效促进萌动胚的胚根伸长和发育成苗。     

百合幼胚的离体培养和植株再生

为了探索百合幼胚离体培养的最佳胚性生长条件及植株再生途径,以授粉后３５ｄ的百合幼胚为外植体,进行了幼胚胚性生长,愈伤组织的诱导,愈伤组织不定芽、不定根的分化和再生植的移栽试验,结果表明;在含有１ｍｇ／ＬＩＡＡ〈１ｍｇ／ＬＧＡ３,６００ｍｇ／ＬＣＨ的ＭＳ培养基上培养,蔗糖含量为６－８％时,百合幼胚胚性生长最好,１ｍｇ／ＬＩＡＡ,１ｍｇ／ＬＧＡ３,６００ｍｇ／ＬＣＨ的ＭＳ２基上培养,蔗糖含量为６－８％     

小麦成熟胚离体培养研究

以美国小麦品种Overley成熟胚作为外植体进行离体培养,研究外源激素对小麦成熟胚诱导愈伤组织、分化出苗以及试管苗增殖的影响。试验结果表明,在MS培养基中添加2,4-D3mg·L-1愈伤组织诱导频率较高,成愈率为84.0%;在添加有KT2～3mg·L-1的MS分化培养基中愈伤组织分化率较高,可达85%以上;将试管苗转接至添加0.2mg·L-1的NAA和0.5～2.0mg·L-1的6-BA的培养基中,试管苗有一定的分化增殖,但最高分化率仅为33.3%,增殖系数2.05。