条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库构建及表达序列标签分析

 以小麦品种水源11和条锈菌CY31号小种为材料,用SMARTTMcDNA Library Construction Kit构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。得到原始文库的滴度为6×10⁶pfu/mL,扩增文库滴度9×10⁹pfu/mL,重组率98%,插入片段在0.5~2.2kb。随机挑取600个克隆,测序获得594条高质量ESTs,与GenBank序列进行BLASTx分析,已知功能ESTs与植物同源比例最高,占44%;其次为真菌,占32%;有18%ESTs在GenBank中没有匹配的同源产物。蛋白功能分析表明,PIG28编码蛋白、ABC转运子、金属硫因、泛素、质膜H⁺-ATPase和氨基酸透酶等可能参与了寄主与病原菌互作过程。     

玉米纹枯病菌全长cDNA文库的构建与鉴定

 以玉米纹枯病菌菌丝为材料,利用In-Fusion SMARTer^TM cDNA Lib Construction Kit构建玉米纹枯病菌全长cDNA文库。文库质量鉴定结果表明,文库滴度为1.2×10⁶pfu·mL^-1,重组率为99.2%,插入片段平均长度大于1.0 kb。随机挑取400个白色克隆进行测序,共获得329个高质量EST序列,经聚类拼接后得到250条unique EST,包括36条contigs和214条singletons。在GenBank 进行Blastn 与Blastx 同源比对,有227条EST 与已知核酸或蛋白有不同程度的同源性,占全部EST 的90.8%,其余23条无任何同源性,占9.2%。     

小麦条锈菌cDNA文库构建和表达序列标签(ESTs)分析

 小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)是全世界范围内小麦生产上的重要病原真菌, 但是对小麦条锈菌的基因组和基因功能却了解甚少。为了促进小麦条锈菌基因组学的发展和大规模基因发现, 我们以噬菌体λTrip1Ex2为载体, 采用SMART技术构建了小麦条锈菌萌发夏孢子的cDNA文库。原始文库的滴度为1.1×10⁶pfu/mL, 平均插入片段长度为750 bp。从文库中随机挑取279个cDNA克隆测序, 分析发现这些ESTs的平均GC含量为45.08%。通过聚类分析, 279个ESTs拼接成31个contigs和80 singletons。BLASTx分析表明, 47%的ESTs与GenBank中报道的功能已知或未知蛋白具有相似性。tBLASTx分析表明12个uniseqs与EST数据库中的序列具有相似性, 其中9个是来自担子菌的cDNA文库。几个EST与已知的真菌致病相关基因具有高度相似性。RT-PCR分析了几个基因在小麦条锈菌侵染过程中的表达水平。这些结果为小麦条锈菌夏孢子萌发以及侵染寄主过程中的基因表达研究奠定了很好的分子生物学基础。     

灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

以灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）mRNA为起始模板,利用Gateway技术构建了灰飞虱酵母双杂交cDNA文库。经过检测表明：构建的初级cDNA文库的库容量为1.85×107 cfu;扩增文库滴度为7.7×108 cfu/mL,重组率约为97%;扩增文库插入片段主要集中在1 000~1 500 bp之间。随机挑取10个克隆,经测序与GenBank数据库比对结果显示7个克隆具有同源序列,其中L2、L9为已公布的灰飞虱序列。灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究灰飞虱与其传播的水稻病毒间的互作奠定了基础。     

模式贝类Helix aspersa Mueller触角cDNA文库的构建

利用Trizol试剂,从实验室培养的模式贝类散大蜗牛(Helix aspersa)成体触角中提取总RNA;应用SMART技术,反转录合成cDNA第1链,长距离PCR扩增得到双链cDNA,分级分离后将片段插入λTripIEx2,再经包装完成蜗牛触角的cDNA文库构建。经平板培养及蓝白斑法检测,未扩增文库滴度达到1.22×106 pfu/mL,扩增文库滴度达到5.6×109 pfu/mL,重组率达到96.4%以上。挑取部分克隆转成质粒,酶切分析显示插入片段平均长度大约为500 bp。经过上述工作,得到了一个高质量散大蜗牛触角cDNA文库,为进一步研究陆生贝类化学感受相关基因及其与行为的相互关系奠定了基础。     

白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交cDNA文库构建及其利用

 拟南芥广谱抗病基因RPW8对拟南芥白粉病菌、霜霉病菌和烟草花叶病毒等均具有抗性。为了深入研究其广谱抗病机制,筛选鉴定与RPW8具有直接相互作用的蛋白,我们以含有RPW8的拟南芥纯合转基因系S5为材料,接种拟南芥白粉菌系UCSC1,36 h后取样,构建了白粉菌侵染初期的拟南芥cDNA文库。为了提高文库对长片段基因5′端的覆盖率,分别使用含有oligo(dT)和oligo(dN)的接头引物反转录cDNA第一链,PCR扩增双链cDNA。将纯化后的双链cDNA与线性化载体pGADT7-Rec混合,利用同源重组技术在酵母菌株Y187中构建cDNA文库。经检测,文库转化效率为5.0×10⁶/3 μg pGADT7-Rec,滴度为2.5×10⁸ CFU·mL^-1,插入片段长度在350～2 000 bp之间,平均插入片段大小为750 bp。用RPW8.1和RPW8.2构建诱饵载体,分别获得11和12个候选互作蛋白。结果表明此cDNA文库质量较好,适用于互作蛋白的筛选。     

铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库的构建及质量分析

为了研究铜绿丽金龟(Anomala corpulentaMotschulsky)成虫嗅觉相关蛋白的功能,本文以铜绿丽金龟雌成虫触角为原始材料提取总RNA,利用SMART技术构建了铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库。经测定,原始文库滴度为6.74×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为1.08×1010pfu/mL,文库重组率为98.98%。随机挑取24个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段的大小在0.5~2.0kb之间,片段平均长度为1.0kb左右。经过菌液PCR并测序筛选cDNA文库,本试验获得了两条编码气味结合蛋白的全长基因序列AcorOBP1和AcorOBP2。以上数据表明,已获得高质量的铜绿丽金龟触角全长cDNA文库,并筛选、克隆获得了气味结合蛋白基因序列。这为进一步研究触角内气味结合蛋白的功能奠定了基础。     

蜡质芽孢杆菌R2防治水稻纹枯病研究

 选用我们从稻株上分离筛选的能促进水稻生长发育的蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)R₂号菌株,分别在室内和田间测定其对稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1)的拮抗性和防病效果。在PDBA平板上,R₂对病菌菌丝生长的抑菌带可达10.9mm宽。在WA平板上可抑制病菌菌核萌发,R₂菌量为4×10⁶、2×10⁷、2×10⁹cfu/ml时,病菌菌核萌发菌丝指数分别较对照降低28.2%、39.7%、56.4%。用菌量为2×10⁹cfu/ml的R₂菌液处理人工接种病菌的离体稻叶,对纹枯病病斑扩展的控制效果为55.5%,随R₂菌量降低,其控制效果相应递减。用菌量为4×10⁷cfu/ml的R₂菌液喷施田间人工接种病菌的稻株,对纹枯病的防效可达43.8%。     

稻瘟病菌附着胞差异表达基因文库的构建方法

 利用抑制性差减杂交方法构建了稻瘟病菌分生孢子接种24h所形成的附着胞差异表达基因文库。采用复印胶片诱导稻瘟病菌附着胞形成,在孢子浓度为1.0×10⁶个/mL时,附着胞的形成率达到96.5%。分别提取附着胞、菌丝和分生孢子RNA,反转录成cDNA并经Alu Ⅰ酶切、接头连接后,以附着胞cDNA片段为tester,菌丝及分生孢子cDNA为driver进行抑制性差减杂交,构建成差减文库。从文库中分离获得142个基因片段,通过RT-PCR方法鉴定其中的71个为差异表达基因,证实文库高效可靠。构建优质的稻瘟病菌附着胞差异表达基因差减文库,为深入了解附着胞形成过程中基因的表达及功能奠定了基础。     

玫烟色棒束孢对多种刺吸式口器害虫防治潜力的室内评测

刺吸式口器昆虫常发生严重且抗药性强。本文室内测定了玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea Ifu13a对梨冠网蝽、小绿叶蝉和温室白粉虱等多种刺吸式口器害虫的控制潜力。在1.0×10⁸、1.0×10⁷和1.0×10⁶孢子/mL接种浓度下,在处理后初始2 d保持RH（95±5）%,随后8 d保持RH（78±5）%的条件下,小绿叶蝉和温室白粉虱成虫的累积死亡率均达到100%,其致死中时LT₅₀分别为4.12、4.11、5.43和4.77、5.55、5.32 d,而梨冠网蝽的致死中时为7.32、8.22、9.79 d。在1.0×10⁸和1.0×10⁷孢子/mL浓度下,小绿叶蝉和温室白粉虱累计死亡率均在5 d内即达到100%,2种害虫的致死中浓度LC₅₀分别为3.90×10³和3.03×10⁴孢子/mL;而梨冠网蝽第10 d在2种浓度下的累计死亡率分别达到了81.25%、77.5%,其LC₅₀为6.88×10⁵孢子/mL。菌株Ifu13a显示出一定的寄主专化性,菌株Ifu13a显现了对多种刺吸式口器害虫的高控制潜力。     

辣椒疫霉侵染拟南芥的酵母双杂交cDNA文库构建及其应用

正辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的植物病原卵菌,其寄主范围较广,可引起辣椒、番茄、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物的疫病。辣椒疫病是一种毁灭性病害,在田间发病经常造成幼苗猝倒、茎秆枯死和果实腐烂,危害相当严重,每年给全世界蔬菜产业造成的损失就高达10亿美元~([1])。辣椒疫病1918年在美国首次发生,之后在世界范围内迅速扩展。20世纪50年代我国最早在江苏     

三株球孢白僵菌的分离鉴定与其对粘虫的室内毒力

通过黄粉虫虫饵法从河北省采集的土样中分离得到三株昆虫病原真菌,结合形态学特征和rDNA序列分析对菌株进行了鉴定,结果表明：三株均为球孢白僵菌Beauveria bassiana,编号依次为Z-G2-5、M-G4、M-G3。通过生测发现3株球孢白僵菌菌株均能有效感染粘虫幼虫,三株球孢白僵菌对粘虫3龄幼虫的毒力不同：在5×10⁸孢子/mL剂量下,菌株Z-G2-5第6 d时对粘虫的累计校正死亡率达到96.77%,LT₅₀为3.02 d,LC₅₀为4.95×10⁶个孢子/mL。而菌株M-G3、M-G4的累计死亡率分别为66.67%、71.11%;LT₅₀分别为4.89 d、3.97 d;LC₅₀分别为1.18×10⁸个孢子/mL、1.13×10⁷个孢子/mL。上述结果表明,相比其他两株菌,菌株Z-G2-5对粘虫的致病力更强,致死速度更快,具有较大的应用价值,可作为粘虫幼虫生物防治的候选菌株。     

金龟子绿僵菌对石蒜绵粉蚧的室内毒力与防治效果

石蒜绵粉蚧是近年我国新记录的一种有害生物,目前在福建省漳州地区的多肉植物种植基地发生为害严重。为探讨金龟子绿僵菌F061和FM-03对该虫的生防潜力和应用前景,本研究测定这2株菌株对石蒜绵粉蚧的室内毒力和防治效果。结果表明,石蒜绵粉蚧受菌株F061和FM-03侵染10 d后1×10⁸孢子/mL处理浓度的累计校正死亡率分别为83.15%和91.95%;构建的2个TDM模型均通过Pearson卡方和Hosmer-Lemeshow检验,2株菌株对石蒜绵粉蚧的时间-剂量互作效应明显,剂量效应随侵染时间的延长逐渐升高,时间效应随菌液浓度的升高逐渐增强,菌株F061侵染10 d后的LC₅₀和1.00×10⁸孢子/mL处理的LT₅₀分别为5.55×10⁵孢子/mL和5.04 d,而菌株FM-03在同等条件下的LC₅₀和LT₅₀分别为1.11×10⁵孢子/mL和4.67 d,毒力强于菌株F061;此外,2株菌株1.00×10⁸孢子/mL处理浓度对石蒜绵粉蚧的室内防治效果也随试验时间的延长而提高,菌剂F061和FM-03喷施10 d后的室内防治效果分别为74.06%和81.32%。综上,2株菌株均可用于防控多肉植物上的石蒜绵粉蚧,菌株FM-03可优先开发应用,菌株F061可作为备选菌株使用。