猪瘟胶体金免疫层析快速诊断法的建立及应用

运用胶体金免疫层析技术,建立一种操作简单、灵敏度高、特异性好,能区分强弱毒感染,适合临床诊断的检测猪瘟病毒的方法。本试验利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白作为弱毒抗原,利用PK15细胞培养纯化后的猪瘟病毒强毒用作强毒抗原,研制了胶体金免疫层析猪瘟病毒抗体检测试纸条。结果显示,经过37℃破坏,该试验方法制备的试纸条仍具有很好的稳定性;与间接血凝法、美国IDEXX酶免试剂比较,发现该试纸条灵敏度在一定程度上优于前者;用多种病毒、病原菌阳性血清考核,显示该试纸条亦具有较高特异性。该试纸条的研制为猪瘟的快速诊断提供了一种更加实用的方法。     

金标法与ELASA检测3种猪病的对比试验

正1检测卡的原理检测卡利用抗体快速金标检测卡法(简称金标法)检测抗体效价。金标法是在酶联免疫吸附法的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其检测原理是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用,标本中的抗体与胶体金结合的抗原相结合,再通过与膜上包被的抗原结合显色而达到检测目的。金标法的试剂为试纸条形式,即为金标试纸条。判定标准:猪瘟、口蹄疫抗体阳性≥1:32(5log2),蓝耳抗体阳性≥1:40;猪瘟、口蹄疫抗体阴性1:32(5log2),蓝耳抗体阴性1:40。     

种猪猪瘟单抗的检测

本文应用猪瘟单抗酶联试剂先后检测了２０９份种猪血清抗体。１９９７年检测结果表明：猪群的猪瘟弱毒抗体阳性率为２９４％,强毒抗体阳性率为９２％。说明该猪群免疫效果不确实,且有猪瘟强毒感染。通过加强免疫和淘汰强毒抗体阳性猪,使得猪瘟弱毒抗体阳性率在１９９８年达到了８１０％,猪瘟强毒抗体阳性率下降为１０％。对强毒阳性猪再淘汰,并加强消毒,基本上净化了该猪场。说明猪瘟单抗酶联试剂可用于检测猪瘟的免疫水平,同时对种猪的隐性感染可作出早期诊断。     

猪瘟免疫监测中微量间接炭凝与间接血凝的对比试验

猪瘟是一种常见病、多发病,临床发病较多,检测抗体仍然是实验室中常用的检测方法。为了验证微量间接炭凝集试验在监测猪抗体水平上的作用,我们进行了微量间接炭凝和间接血凝的对比试验。本试验采用炭凝抗原与血凝抗原,在U型板上检测待检血清。通过对比发现,微量间接炭凝集试验与在实践上推广应用的间接血凝有类似的效果,而微量间接炭凝集试验的抗原制作成本低廉,可以长期保存,经验证后有望在基层推广应用。     

猪瘟的快速诊断——用反向间接血凝试验检测猪瘟抗原

以猪瘟免疫血清提取1gG,致敏用丙酮醛、甲醛固定的绵羊红血球,作反向间接血凝试验,可以检出猪瘟病料(脾及淋巴结)中的抗原。以其他IgG,如出败血清IgG、正常猪IgG致敏的血球作对照试验,非特异性凝集极小。以健康猪或其他高热病如出败、猪丹毒、弓形体病猪脾脏作阴性样品对照,血凝滴度也很低或阴性。以猪瘟高免血清作血凝抑制试验,有明显抑制作用。说明这种试验,对猪瘟抗原是有特异性的,可以作为猪瘟诊断用。 在40头血毒猪中,其脾脏有31头(77.5％)是阳性,淋巴结有30头(75％)是阳性。在此40头猪中,仅有3头在脾或淋巴结均为阴性,未检出抗原,因此,实际有37头(92.5％)的脾脏或淋巴结或两者都检出猪瘟抗原。但是,在病猪血液中不能检出抗原(凝集滴度过低),在脾脏浸出液中,如含有血色素过多,也不易检出。在新鲜采取的脾脏或淋巴结中,非特异性凝集不易排除,影响检出结果。脾脏或淋巴结1克剪碎,加蒸馏水或生理盐水5毫升,在8—10℃静置1—2天后,即可排除大部分非特异性凝集。堪称猪瘟诊断中最简便的方法之一,具有血清学的一般特异性。但尚缺乏天然病例的试验。     

绿兴猪场猪瘟抗体研究

为了探索绿兴种猪场的猪群猪瘟抗体水平,于2009～2012年用正向间接血凝试验试剂盒对绿兴种猪场的猪群进行猪瘟抗体水平检测,同时对3年的检测结果进行比较。结果表明,该猪场2009～2012年整体抗体水平差异显著(P<0.05),抗体保护价逐年提升,猪瘟抗体保护水平都达到1∶16效价的为100%,每年半数以上的猪只抗体效价达到了1∶64,表明该猪场整体的猪瘟保护水平很高。3个班的检测结果差异不显著(P>0.05),结果可信、准确。该研究为各规模化猪场采用正向间接血凝试验监测猪群的猪瘟免疫抗体水平提高借鉴。     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95.56%;间接血凝试验结果效价在1∶16以上(含1∶16)的血清样品为88份,占总样品比例的97.78%,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95．56％;间接血凝试验结果效价在1：16以上（含1：16）的血清样品为88份,占总样品比例的97．78％,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。     

非洲猪瘟病毒无标签重组K205R抗原制备与应用

为建立敏感、特异的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,将ASFV K205R基因与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用相变循环纯化ELP-K205R融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,用相变循环回收K205R蛋白,用抗体阳性血清对重组K205R蛋白进行ELISA鉴定。结果表明:重组大肠埃希菌能正确表达ELP-K205R融合蛋白,相变循环纯化的融合蛋白纯度大于80%; TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,回收的重组K205R蛋白纯度大于95%,能被特异抗体阳性血清识别;重组K205R抗原与抗体阴性猪血清反应阴性,与抗体阳性猪血清反应阳性,D_(450 nm)值与血清稀释倍数具有线性相关性。用重组K205R抗原对已知猪血清进行ELISA检测,结果显示24份ASFV抗体阳性血清为检测阳性, 24份ASFV抗体阴性血清为检测阴性,检测符合率为100%。这一研究提示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体检测。     

胶体金免疫层析法检测猪瘟(强弱毒区分)抗体研究

以原核表达的重组猪瘟病毒E2蛋白为弱毒抗原,以猪瘟病毒(HCV)强毒株细胞培养物为强毒抗原,利用胶体金标记技术国内首次建立了HCV抗体检测(强弱毒区分)的免疫层析试纸条(双抗原夹心法)。研究结果表明,检测时只需将80μL待检测猪血清加于加样端20 min后观察结果即可。若观察区上端仅1条红色条带,即为HCV抗体阴性;2~3条条带即为HCV抗体阳性;若出现2条条带的位置为观察区上端和中间部位,即为HCV弱毒抗体阳性;若出现2条条带的位置位于观察区上端和下端部位,则为HCV强毒抗体阳性;若出现3条条带则HCV强弱毒抗体均为阳性。本试纸可很好地避免因试验操作造成的假阳性、假阴性,且操作简单、快速、简便、灵敏度高、特异好、不需特殊设备、价格低廉,20 min即可判断结果,且可区分强弱毒感染,适于基层实验室和现场检测。     

猪鼻支原体间接血凝及EUSA检测方法的初步建立

本试验旨在建立猪鼻支原体间接血凝及ELISA检测方法,为猪鼻支原体的血清学诊断、流行病学调查及防控提供技术基础。利用Mhv全茵及P37蛋白为抗原．通过间接血凝及ELISA方法检测抗体,初步建立猪鼻支原体血清学检测方法。结果表明：利用Mhv全茵抗原建立的间接血凝法检测猪鼻支原体阳性血清具有较高的抗体效价。但与猪肺炎支原体阳性血清存在严重的交叉反应：这些结果提示Mhv全茵间接血凝及全茼包被ELISA方法检测Mhp血清与Mhp存在严重交叉反应,而P37包被ELISA不存在交叉反应。     

猪鼻支原体间接血凝及EUSA检测方法的初步建立

本试验旨在建立猪鼻支原体间接血凝及ELISA检测方法,为猪鼻支原体的血清学诊断、流行病学调查及防控提供技术基础。利用Mhv全茵及P37蛋白为抗原．通过间接血凝及ELISA方法检测抗体,初步建立猪鼻支原体血清学检测方法。结果表明：利用Mhv全茵抗原建立的间接血凝法检测猪鼻支原体阳性血清具有较高的抗体效价。但与猪肺炎支原体阳性血清存在严重的交叉反应：这些结果提示Mhv全茵间接血凝及全茼包被ELISA方法检测Mhp血清与Mhp存在严重交叉反应,而P37包被ELISA不存在交叉反应。     

免疫猪群暴发猪瘟的诊断与分析

对某种猪场猪瘟免疫猪中暴发的一种高热、高死亡率传染病进行流行病学调查、病理变化观察和免疫荧光抗体检查,确诊该种猪场所暴发的传染病为猪瘟。此外,用间接血凝试验对21日龄超前免疫仔猪的血清中猪瘟抗体水平进行了检测,结果表明,仔猪的免疫合格率为78 9%。     

鸭病毒性肝炎间接血凝诊断抗原的制备

【研究目的】建立一种便于检测鸭病毒性肝炎抗体的方法。【研究方法】将纯化的鸭病毒性肝炎I型病毒(DHV-I)致敏双醛化红细胞,制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原。【研究结果】使用该抗原对9种常见的禽传染病阳性血清、15只随机抽样的非免疫鸭血清进行检测,抗体均为阴性;检测被鸭病毒性肝炎I型病毒阻断后的阳性血清,抗体为阴性;用不同批次的诊断抗原检测同一血清样品结果显示一致;敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍;对15只随机抽样的免疫鸭进行检测,阳性率达93%。【结论】该方法敏感性较高、特异性强、重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及鸭病毒性肝炎的流行病学调查。     

免疫细胞化学技术在药学研究中的应用

免疫细胞化学又称免疫组织化学,其主要原理是用标记的抗体(或抗原)对细胞或组织内的相应抗原(或抗体)进行定性、定位或定量检测,经过组织化学的呈色反应后,用显微镜观察。凡是能做抗原、半抗原的物质,如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其用免疫细胞化学手段检出和研究。     

诊断猪瘟病的理想试剂——抗猪瘟病毒单克隆抗体

<正> 目前,我国普遍应用猪瘟兔化弱毒苗,因而绝大多数猪的体液内都含有特异性抗体,也就无法应用检查特异性抗体的办法来诊断猪瘟病。近年来,应用猪瘟病毒高免血清标记荧光素诊断新技术,比传统的动物实验、血清学鉴定方法发展了一步。但由于受到同属病毒交叉反应的影响,仍然有相当程度的假阳性,如猪瘟荧光抗体对牛腹泻病毒(称BVDV)、猪瘟兔化弱毒均呈阳性反应. 能够认别单一抗原决定簇的单克隆抗体的出现和应用,解决了这一难题。现将荷兰     

猪瘟流行毒株E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】表达猪瘟保护性抗原E0蛋白,用以建立猪瘟抗体检测方法,为进一步开发诊断试剂盒和研究E0蛋白的免疫学功能奠定基础。【方法】将猪瘟野毒株FJ237-E0基因插入原核表达载体pET32a中,以BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,将表达的重组蛋白通过His亲和层析柱进行纯化,以纯化的His-E0融合蛋白作为诊断抗原,通过探索抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。【结果】成功克隆了CSFV E0基因,其核苷酸序列为687 bp,编码229个氨基酸。经His亲和层析柱纯化检测纯度为0.587 mg/mL;SDS-PAGE电泳结果显示,表达的E0蛋白分子质量约为50.3 ku,表达的重组蛋白为可溶性蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%;ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为100 ng,血清稀释倍数为1∶30,建立的ELISA方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的阳性符合率为92.3%,阴性符合率为85.7%。【结论】建立的ELISA检测方法,不但为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学监测手段,也为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

湖南省猪瘟流行情况的血清学调查

采用ELISA对湖南省规模猪场送检的953份血清进行了猪瘟抗体的检测,对305个病例(场次)进行了猪瘟抗原的检测。结果表明未免疫猪的抗体阳性率仅为2%,免疫猪的抗体阳性率为55.59%;305个病例(场次)其猪瘟抗原的阳性率为61.97%。     

绵羊肺炎支原体间接血凝诊断方法的建立

用绵羊肺炎支原体抗原致敏经戊二醛处理的绵羊红细胞,制备成间接血凝试验抗原,通过IHA来检测绵羊支原体性肺炎血清抗体.致敏绵羊红细胞的最佳抗原浓度为100μg/mL,血清效价≥1∶8即为阳性,效价≤1∶4者判为阴性.该方法具有很好的敏感性、特异性和可重复性,而且操作简单,适合大范围推广应用.     

应用间接血凝试验(IHA)诊断猪蛔虫病

以猪蛔虫抗原致敏绵羊红细胞制备检测猪蛔虫特异性抗体的间接血凝诊断试剂,与猪蛔虫抗体发生特异性凝集反应.结果表明,用间接血凝诊断试剂对3 000份猪血清进行现场检测,阳性率为30.00%;而琼脂扩散试验(AGP)的阳性率为13.00%,表明,间接血凝试验(IHA)比GAP敏感,间接血凝诊断试剂可用于猪蛔虫病的快速诊断.