四氢嘧啶对热变性凝乳酶复性作用的研究

[目的]加深对部分失活的凝乳酶复性作用的了解,为热稳定性研究中部分失活态凝乳酶的制备提供参考。[方法]研究了四氢嘧啶存在的条件下,复性时间、热处理时间和热处理温度等因素对凝乳酶复性作用的影响。[结果]随着复性时间的延长,凝乳酶的活力逐渐上升。凝乳酶的复性主要发生在前24 h,36 h后凝乳酶活力基本保持稳定,复性后凝乳酶相对酶活力最高可提升21.8百分点,能够测到凝乳酶活力(相对酶活力损失93.3%)的热处理时间,从6 min延长到12 min。在酶活力损失相近时,含四氢嘧啶的凝乳酶在较高温度下(68~70℃)保温较短时间(1~5 min),复性所致的相对酶活力提升显著高于在较低温度下(61~65℃)长时间保温(30~180 min)。[结论]酶的热失活处理的温度和时间对酶分子结构的影响效应并不相同,较长时间的热失活处理比短时高温对酶结构的破坏更彻底。     

重组大肠杆菌全细胞催化合成四氢嘧啶

四氢嘧啶是天冬氨酸的环状氨基酸衍生物,广泛应用于化妆品、食品、药品等领域。通过比较了5个不同来源的四氢嘧啶合成基因簇ectABC,发现从专性嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus OF4)来源的基因簇整合到大肠杆菌BW25113中后,得到的重组菌pYB1s-BPectABC/BW25113产四氢嘧啶能力最好。利用单因素试验初步优化了pYB1s-BPectABC/BW25113全细胞催化条件:以100 mmol·L^-1天冬氨酸钠和100 mmol·L^-1甘油为底物,在100mmol·L^-1 KCl的转化液(pH=7.0)中,30℃下反应24h,最终四氢嘧啶的产量可达3.10g·L^-1,转化产率达到0.129g·L^-1·h^-1。本研究初步得到了四氢嘧啶合成重组菌pYB1sBPectABC/BW25113,为后续四氢嘧啶的研究奠定了基础。     

海藻酸钠固定化中性蛋白酶的研究

探讨了中性蛋白酶在海藻酸钠中的固定化技术,并对影响固定化酶的固定化率和固定化酶活性的 因素进行了研究。结果表明,固定化酶的质量受海藻酸钠浓度、固定化酶量、固定化时间以及CaCl2浓度的影响,其 最佳工艺条件为:海藻酸钠浓度3．0％,固定化酶液量与海藻酸钠体积比1:2,固定化时间2．5 h,CaCl2浓度 3．0％,由此制得的固定化酶的固定化率可达97．5％,固定化酶活性为3 600 U／g,其热稳定性、pH值稳定性均极显 著高于游离酶。     

用中性蛋白酶水解螺旋藻的试验研究

研究了不同反应体系和不同反应条件对中性蛋白酶水解螺旋藻效果的影响。结果表明：（１）底物浓度愈低,加入酶液量愈大,水解率愈高;（２）反应时间愈长水解率愈高,反应温度４５℃,ｐＨ值７时,水解率最高。     

温度、复配原料和中性蛋白酶活力的相关性研究

研究温度、复配原料对中性蛋白酶酶促反应速度的影响,观察酶活性变化规律,从而探索最佳条件为生产应用提供科学依据.     

N+注入中性蛋白酶高产菌株诱变选育的研究

    利用低能N+注入技术对产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行诱变选育.以提高该菌株的产酶能力.试验结果表明,茵株的存活率曲线是典型的"马鞍型"剂量一效应曲线,在注入剂量为(30-50)×1014ions.cm-2的区域内具有高的正突变率.在注入能量为30 keV、注入荆量为50×1014ions.cm-2的条件下,经过筛选最终获得l株遗传稳定性良好的高产茵株NP131,其所产中性蛋白酶活力稳定在15230 U.mL-1左右,较出发茵株提高了71.2%.比较突变茵株NP131与出发菌株的产酶曲线,发现2条曲线的变化规律一致.说明离子注入技术是一种比较理想的微生物茵种选育方法.     

中性蛋白酶水解蛋清蛋白的工艺

通过单因子试验及正交试验,确定中性蛋白酶水解制备蛋清蛋白肽的最佳工艺条件为底物溶液pH值为7.0、加酶量5 000 U.g-1、水解温度为55℃,水解6 h,氮回收率为49.22%。     

中性蛋白酶水解乳清蛋白条件的研究

以A.S1398中性蛋白酶水解乳清蛋白制取乳清蛋白水解液。通过单因素及L9(34)正交实验优化水解工艺条件,在优化的工艺条件下,乳清蛋白的水解度可达20.31%。     

易变链霉菌TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因的克隆

为了探索嗜盐放线菌对高盐环境的适应机理,以分离于罗布泊易变链霉菌TRM 45540为材料,利用分子克隆技术,构建四氢嘧啶异源生物合成工程菌(以E.coli为宿主),对ectA、ectB、ectC与ectABC基因进行异源表达,分析异源宿主菌的耐盐能力。结果表明:TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因ectA为474bp,预测编码蛋白为19ku;ectB为1 272bp,预测编码蛋白为44.6ku;ectC为399bp,预测编码蛋白为19ku;全长基因ectABC为2 403bp,并且携带有ectABC基因工程菌的耐盐能力显著提高。     

中性蛋白酶酶解绿豆蛋白制备寡肽的研究

[目的]利用中性蛋白酶将绿豆蛋白质水解成肽和氨基酸,通过优化酶解条件得到水解度较高的绿豆肽。[方法]选用中性蛋白酶对绿豆分离蛋白进行酶法水解以制备寡肽。在单因素考察的基础上,采用四因素三水平的正交试验设计优化酶解条件。[结果]试验得出,最适的反应条件为温度50℃、pH值6.5、底物浓度7%、酶浓度6000 U/g、水解时间240 min。[结论]绿豆分离蛋白在此条件下酶解,水解度的平均值可达28.82%。     

中性蛋白酶酶解谷朊粉制备抗氧化多肽研究

以谷朊粉为原料,采用中性蛋白酶制备抗氧化多肽,并对其酶解工艺进行优化。结果表明,对中性蛋白酶酶解谷朊粉制备抗氧化多肽的影响顺序依次为酶解温度>加酶量>酶解时间;通过响应面分析优化酶解条件为底物浓度8%,加酶量2 800 U/g,温度52℃,时间280 min,此时酶解液羟自由基清除率达到65.3%,多肽含量为60.4 mg/mL。     

中性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽的研究

研究了AS1398中性蛋白酶酶解鸡蛋蛋清制备小分子活性肽,确定了酶解的最佳工艺:pH值8.0,酶解温度60℃,底物浓度4%,酶加入量为底物浓度的7%,水解时间4h.在此条件下,水解度达到26.1%.用SephadexG-15测定了水解物分子量分布,结果表明:水解产物中的主要成分是分子量集中在1 300Da的寡肽.     

核桃蛋白中性蛋白酶水解物的制备及其抗氧化活性研究

[目的]研究制备核桃蛋白水解物的最佳工艺条件及水解物的抗氧化活性。[方法]以核桃蛋白为底物,采用正交试验研究制备其中性蛋白酶水解物的工艺条件,通过测定自由基清除能力研究酶水解物的抗氧化活性。[结果]制备核桃蛋白酶水解物的最优工艺条件为:温度40℃、底物浓度4%、酶浓度4 000 U/g、pH值8.0;核桃蛋白酶水解物的水解度与其对羟自由基(OH.)和超氧阴离子自由基(O2.)的清除能力有关,其水解度为24.2%时对羟自由基(OH.)和超氧阴离子自由基(O2.)的清除率分别为17.0%和52.0%。[结论]采用Sephdex G-25凝胶柱层析对水解度为24.2%的酶水解物进行分离,得到了A、B、C和D 4种肽混合物,其中,肽混合物C的自由基清除能力最大,肽混合物D最小。     

中性蛋白酶与超声波结合分离稻米淀粉及其黏滞性研究

用中性蛋白酶与超声波结合提取稻米淀粉,并用快速黏度分析仪测定稻米淀粉的黏滞性。结果显示,用中性蛋白酶提取稻米淀粉时,稻米淀粉的提取率为62.3%～73.8%,淀粉中蛋白质含量为3.74%～4.88%;蛋白酶与超声波结合时稻米淀粉的提取率为72.1%～77.2%,蛋白质含量为0.68%～1.30%,破损淀粉含量显著降低,两者结合的最佳条件是酶先作用3h,再50%超声波作用40min。中性蛋白酶与超声波结合处理所得淀粉的黏滞谱中,峰值黏度、消减值和最终黏度都比单独酶解所得淀粉的高,而崩解值降低;与碱处理淀粉比,也是峰值黏度、消减值和最终黏度升高,崩解值降低,这说明超声波作用没有破坏淀粉性质。中性蛋白酶与超声波结合是提取稻米淀粉的有效方法。     

添加剂对纤维素酶耐温性的影响

为提高纤维素酶在较高温度条件下的耐温性,考察5种添加剂（聚乙二醇、甘油、木糖醇、氯化钙、黄原胶）对纤维素酶酶活的影响。结果表明,在58℃、保存24 h条件下,聚乙二醇、甘油、木糖醇、黄原胶对纤维素酶酶活有保护效应,较未添加时的相对酶活有所增加。木糖醇的保护效应最为显著,相对酶活由0.59提高到0.94;而氯化钙对酶活有抑制效应,相对酶活由0.59降低为0.49。     

解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

为了获得高效的中性蛋白酶基因,试验用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌中扩增中性蛋白酶基因(npr),通过Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,将该基因与表达载体PET-28a连接,同时转入到大肠杆菌BL21中表达,通过SDS-PAGE电泳技术对构建的工程菌的基因表达产物进行分析。获得特异npr基因序列含1 566 bp,编码522个氨基酸,含有完整的ORF,同源性达到100%。蛋白酶的分子量为57.4 k Da。IPTG能诱导中性蛋白酶基因在重组菌进行表达,通过改变IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等因素,得出在添加剂IPTG至终浓度为0.8 mmol·L-1,30℃诱导4 h为最佳诱导条件,获得最高酶活为450 U·m L-1。     

球孢白僵菌胞外蛋白酶产生水平及其与毒力关系的研究

检测了球孢白僵菌不同类型分离株的胞外蛋白酶产生水平,总体显示出继代培养将降低菌株胞外蛋白酶活性,胞外蛋白酶产生水平与菌株毒力有一定的协同性,但相关不显著。     

高温中性蛋白酶基因的克隆及毕赤酵母表达研究

对地衣芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶进行了克隆,并在毕赤酵母中进行了表达.以高温中性蛋白酶产生菌地衣芽孢杆菌XJT9503基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得高温中性蛋白酶(Tnp)基因的特异性片段,大小约为1 kb.通过EcoRI、NotI 双酶切后,将该基因连入毕赤表达载体pPIC9K,并整合到毕赤酵母SMD1168基因组中,构建的基因工程菌,进行甲醇诱导表达.结果表明,基因工程菌发酵72 h,有最大酶活,为19 U/mL;酶的最适作用温度为65℃,与原始酶的最适作用温度相符.证明研究成功克隆了高温中性蛋白酶基因,并在毕赤酵母中正确表达.