新城疫病毒HN基因的克隆与原核表达

根据GenBank公布的标准Lasota株的HN基因序列,设计了一对引物,经RT-PCR从标准Lasota疫苗毒中特异性扩增出约1590bp的HN基因。将扩增得到的基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-NDV/HN,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌BL21(pET-NDV/HN)。将重组菌诱导表达后,通过SDS-PAGE分析可见约64.3kDa的特异条带,说明融合蛋白大小与预期理论值相符;Western blotting结果进一步表明表达的蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。     

新城疫病毒HN基因主要抗原位点区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒GD/GM/03/Ch的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定169～267位氨基酸、318～405位氨基酸和448～571位氨基酸3个区域作为多肽表位候选区域.用含新城疫病毒HN基因的重组质粒为模板,设计引物通过PCR扩增获得HNa、HNb和HNc 3个抗原结构域基因片段,分别经双酶切定向克隆到原核表达载体pBT上进行表达,并构建了pBT-HNa-b-c串联重组质粒进行表达,经过SDS-PAGE和Western-blot分析,验证了表达产物具有反应原性.     

鸡新城疫病毒HN基因片段的原核表达及其单抗制备

[目的]研究NDV-HN蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点。[方法]根据HN基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计1对引物,以该实验室保存的重组质粒为模板,进行PCR扩增,再将其所得片段定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒,并对该重组质粒进行鉴定;再将构建的重组质粒在大肠杆菌中表达;最后,鉴定了相应单克隆抗体。[结果]PCR结果表明,得到了与预期结果一致的长度为850 bp的片段;重组质粒鉴定结果表明,成功构建了包含目的基因片段的重组表达质粒pGEX-4T-HN23;重组质粒经原核表达获得大小为57 kD的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠试验表明,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代（可传20代以上）和分泌抗NDV-HN抗体的杂交瘤细胞株。[结论]获得的鸡新城疫病毒HN单克隆抗体,为进一步研究HN在致病过程的作用及特异性诊断提供了重要试验材料。     

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得新城疫病毒(NDV)Lasota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因片段,其长度约为1.7 kb,与已报道的NDV-HN基因片段大小一致.再将该HN基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,表明构建的重组质粒含有NDV-HN基因片段.     

新城疫病毒HN基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法扩增新城疫病毒HN基因并将其克隆至T载体,测定其核苷酸序列.尔后用PCR扩增球状头部编码区,并将其克隆至pSOC质粒soc基因3端EcoR Ⅰ位点,重组质粒pSOC-HN转化E.coli BL-21(DE 3)感受态细胞,以终浓度1 mmol/L的IPTG诱导表达,在SDS-PAGE凝胶上可检测到分子量约67 KD的融合蛋白特异条带,west-blot证实表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性.     

新城疫病毒F和HN基因真核表达载体的构建

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F、HN基因序列和真核细胞表达载体pEGPF-N1的克隆位点,分别设计一对引物,通过PCR方法获得了F、HN基因,经回收纯化,将产物连接到克隆载体pMD18-T上。酶切鉴定和序列分析后,再将目的基因亚克隆到真核细胞表达载体pEGPF-N1上,经鉴定,成功构建含有NDVF和HN基因的真核细胞表达载体pEGPF-N1-F和pEGPF-N1-HN,为下一步研究NDVF和HN蛋白在细胞凋亡中的生物学功能奠定基础。     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

鸡新城疫病毒Lasota株HN蛋白主要抗原表位基因在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因,将其克隆到pGEM-T easy vector中,构建了重组质粒pT-HN.设计了1对引物,用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因(442～1 734 bp共1 239 bp),将其连接到原核表达载体pET-28a( ),构建重组质粒pET-HN.用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.SDS-PAGE结果表明,NDV HN主要抗原表住基因在pET-HN中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子量为28 kD.同时,通过试验摸索并确定了表达HN蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,诱导时间为4 h,温度为37℃.     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。     

牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达

根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增.经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功.从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a( )质粒连接,构建pET32a( )-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60 ku.     

新城疫病毒xx08毒株血凝素-神经氨酸酶基因主要抗原区原核表达及鉴定

利用基因工程技术构建新城疫病毒HN基因抗原表位集中区HNI175-K367基因片段(523-1101位)的重组表达质粒pET32-HNI175-K367。将该质粒转化大肠杆菌BL21(ED3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定表明,HNI175-K367蛋白得到高效表达,其分子量约为38kD。Western-blot分析证实,HNI175-K367蛋白与鸡新城疫病毒高免血清发生特异性反应,表明利用原核表达系统获得的重组蛋白具有良好的反应原性。     

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Wester...     

新城疫病毒xx08株HN蛋白主要抗原区的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立检测新城疫病毒(NDV)抗体的间接ELISA方法,构建了新城疫(ND)xx08株HN基因抗原表位集中区基因片段的重组表达质粒p ET28a-r HN,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定表明,表达的重组蛋白大小约为28 ku。Western blot分析表明,该重组蛋白具有良好的反应性。以纯化的HN蛋白为包被抗原建立检测NDV抗体的间接ELISA方法,优化试验条件后,抗原最适包被浓度为5μg/m L,血清最适稀释比例为1∶80,与HI试验结果符合率较高,且与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病(IBV)、鸡禽流感病毒(AIV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等标准阳性血清无交叉反应。表明建立的间接ELISA方法可以用于临床新城疫抗体的检测。     

烟草CSN4基因的原核表达及纯化

以野生型烟草(Nicotiana tabacum)为试验材料,采用RT-PCR克隆获得CSN复合体亚基CSN4c DNA序列,基因登录号为KC866360。序列分析表明,CSN4基因ORF长为1194 bp,编码398个氨基酸,蛋白分子质量为43.78 k Da。将CSN4构建至原核表达载体,获得重组子pET28a-CSN4/BL21(DE3),通过Ni-IDA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western Blotting检测,结果显示:0.25 mM IPTG,15℃诱导16 h获得浓度为0.476 mg/m L、纯度高达95%的CSN蛋白,为后续CSN4基因功能研究奠定了基础。