新城疫病毒F蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达

用自行设计的3对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因3段抗原表位区段,大小分别为81、108、105bp。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将3段抗原表位基因片段拼接成多表位串联基因,大小为306bp。将此基因片段插入含组氨酸(His)基因的质粒pET-32-a中,构建了重组质粒pET-32-a-F306。经诱导表达,获得相对分子质量约为31000的融合蛋白,其中F蛋白抗原表位串联基因片段表达产物约为11000。经亲和层析,获得纯化His-F306融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗新城疫病毒F蛋白抗体。经过琼扩、ELISA及Western-blot检测,表明该融合蛋白中的抗原表位串联基因所表达的蛋白具有良好的抗原性。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。     

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析

应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性.     

新城疫病毒HN基因与T4噬菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中的融合表达

用RT—PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)的完整HN基因序列；设计了1对带有EcoR Ⅰ限制位点的引物，用PCR扩增出了HN基因片段。将该片段克隆至pSOC质粒SOC基因3’端，成功构建了重组质粒pSOC—HN。用该重组质粒转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞，以终浓度1mmol／mL的IPTG诱导表达。在SDS-PAGE凝胶上可检测到分子质量约67ku的特异条带，蛋白质印迹法证实，表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性。     

马动脉炎病毒膜蛋白基因截短型的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

根据马动脉炎病毒膜蛋白(M)的核苷酸序列，设计合成了1对引物，从pUC18-M质粒中扩增出截短的膜蛋白M基因片段。对该片段及pGEX-6P-1载体双酶切并连接，成功构建了原核表达载体pGEX-6P-Mt。将此重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，对培养条件及诱导表达条件等影响表达的因素进行了优化；诱导后菌体裂解物经SDS-PAGE分析发现，在约34ku处出现了1条特异性的蛋白条带，其分子质量与预期的M截短蛋白的分子质量相符，并随着诱导时间的延长而变化，在诱导后4h达到高峰。结果表明，膜蛋白M基因截短型在大肠埃希氏菌中得到了高效表达。     

新城疫病毒F基因的真核表达及其免疫原性检测

为了探讨F基因在DNA免疫防制新城疫(ND)中的免疫原性,将NDV Z株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-H is-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNA NDV ZF。在脂质体作用下将pcDNA NDV ZF转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中可见有大量F蛋白表达。将重组质粒以100μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,经间接ELISA试验检测二免前后的血清,结果证明,pcDNA NDV ZF基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生,具有特定的免疫原性。     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒（NDV）F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a（＋）上,转化E．coliBL21（DE3）,筛选表达NDVF48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDVM蛋白在E．coliBL21（DE3）内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDVM和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b( )载体中,构建了原核表达载体pET-22b( )-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒HeB02分离株F基因的序列分析

根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列，设计了1对引物，并以RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒HeB02分离株的F基因，基因产物大小为1．63kb，与设计相符。对其进行序列测定后，与其他标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行了同源性比较，结果表明，HeB02株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗株LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1％、84.9％和83.8％。由此可以看出，HeB02分离株与标准毒株和疫苗株相比，在F基因上发生了变导。     

不同动物来源的新城疫病毒F基因序列分析

为了解广西地区新城疫病毒（NDV）在不同动物宿主内的分布流行情况,对从广西地区鸡、野鸟、猪、鹅、马等5种不同动物体内分离到 NDV 毒株,进行了 F 基因的克隆扩增和序列分析。结果表明,5个NDV 分离株 F 基因的核苷酸序列同源性为85．2％～98．6％,推导氨基酸序列同源性为88．9％～98．6％,同源性差异较大;5个毒株的 F 基因与国内贵州、长春、福建等地的当前流行株同源性较高;以 F 基因前374 bp核甘酸同源性比较分型表明,鸡源、鹅源、马源毒株为当前流行的基因Ⅶ型,而猪源毒株和野鸟源毒株为传统的基因Ⅱ型。     

新城疫病毒F基因疫苗接种剂量的研究

以新城疫病毒F基因的cDNA与真核表达载体pcDNA3重组 ,构建了新城疫病毒F基因疫苗。采用不同剂量接种SPF鸡后 ,通过抗体监测和强毒攻击试验 ,分析了其诱导的体液免疫应答及免疫保护作用。结果表明 ,接种剂量为1 0 0 ,2 0 0ug时 ,试验鸡在免疫后第 2周出现较明显的抗体反应 ,接种剂量为 1 0ug时抗体变化不明显。以标准强毒F4 8E9攻击后 ,空白对照组及接种剂量为 1 0 ,1 0 0ug组的鸡只全部发病死亡 ,未获得免疫保护 ;而 2 0 0ug组鸡只 30 %存活 ,获得部分免疫保护。表明基因免疫效果与接种的剂量有密切的关系     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表达及鉴定

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株的基因组序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增EMCV VPl基因目的片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了EMCV VPl基因重组表达质粒pET-32a-VP1.将pET-32a-VP1转化BL21(DE3)株感受态细胞,并用IPTG进行诱导表达.结...     

朱鹮新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

新城疫病毒(NDV)的F蛋白与病毒的致病性和免疫应答密切相关。为了了解朱鹮源NDV陕西分离株的变异情况及进化地位,采用RT-PCR方法对NDV陕西分离株F基因的主要功能区片段进行了扩增,并进行了序列测定及遗传进化树构建。序列分析表明,该分离株扩增片段的长度为535 bp,与预期扩增片段长度大小一致。其F基因裂解位点的氨基酸组成与NDV强毒株的特征性结构(112R-R-Q-K-R-F117)一致。系统进化树分析表明,该NDV分离毒株为基因Ⅶ型,与近年来报道的我国家禽流行的NDV基因型一致。