白花泡桐二倍体及其同源四倍体的AFLP和MSAP分析

以二倍体白花泡桐(Paulownia fortunei)及其同源四倍体幼苗为材料,采用AFLP和MSAP分子标记技术分别对其DNA碱基序列和DNA甲基化水平及模式变化进行了分析。结果表明,白花泡桐二倍体及其同源四倍体DNA碱基序列在AFLP水平上相同,同源四倍体白花泡及其二倍体的DNA甲基化水平和甲基化模式存在一定差异。同源四倍体白花泡的DNA甲基化水平较其二倍体高2.08%,同源四倍体白花泡桐的DNA甲基化多态性为34.78%、单态性为65.22%,四倍体白花泡桐DNA甲基化模式变化频率小于其二倍体。     

20株香菇菌株的ISSR和F-MSAP分析

利用简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat,ISSR)和荧光标记甲基化敏感扩增多态性(fluorescence-labeled methylation-sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)分子标记技术对收集到的20株香菇Lentinula edodes菌株进行遗传及甲基化多样性分析。ISSR结果表明,8对引物共可扩增出98条稳定清晰可辨的条带,其中多态性条带89条,多态性比率为90.82%,样品间的遗传相似系数范围为0.520 4~0.9897。F-MSAP结果表明,15对引物共扩增产生13 487个CCGG位点。在全部检测位点中,半甲基化位点为1 704个,平均半甲基化率12.6%;全甲基化位点为1 865个,平均全甲基化率13.8%。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性(methylation sensitive polymorphism,MSP)和甲基化不敏感多态性(methylation insensitive polymorphism,MISP)。Mantel检测结果表明,ISSR与MISP分子标记的分析结果有显著的相关性,但ISSR与MSP分子标记的分析结果无显著相关性。说明香菇不同株系间广泛存在DNA甲基化多样性,在育种中具有重要的应用价值。     

桑树二倍体及人工诱导的同源四倍体遗传差异的SRAP分析

利用SRAP分子标记技术,对8份桑树二倍体品种和经秋水仙碱化学诱变得到的同源四倍体进行DNA遗传差异研究和聚类分析。结果表明:桑树不同材料二倍体及其同源四倍体间的SRAP多态性有明显差异。农桑8号、璜桑37号、湖桑197号、湖桑199号和国桑20号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,无差异,而育71-1二倍体及其同源四倍体的SRAP多态性最高,达到1.41%,所有的二倍体及其同源四倍体材料均聚在一起,不同材料间亲缘关系近的聚为一大类。说明不同桑树材料经秋水仙素诱变后产生的遗传差异较大,桑树二倍体及其同源四倍体产生变异的原因可能是染色体上的等位基因积加效应造成DNA分子遗传结构的改变。     

冷驯化草莓组培苗DNA甲基化水平及模式的变化

DNA甲基化是植物表观遗传的重要方式之一,非生物胁迫会引起植物DNA甲基化水平及模式的改变。为探讨草莓的低温响应与DNA甲基化的关系,本文以章姬组培苗为材料,利用甲基化敏感多态性技术(MSAP)检测冷驯化(4℃)不同时间及恢复后的植株DNA甲基化水平及模式变化。结果表明,14对选择性引物在冷驯化过程中共检测出2499个基因位点;冷驯化过程中,DNA总甲基化水平整体呈下降趋势,0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和10 d,基因组MSAP比率分别为27.17%、20.73%、25.77%、22.69%、22.69%和22.41%,恢复5 d后MSAP比率上升为26.05%;在DNA甲基化模式变化方面,有甲基化和去甲基化现象发生,且以去甲基化现象为主。回收、克隆并测序某些草莓基因组的甲基化修饰位点,分离得到5条存在甲基化修饰的基因组DNA序列。BLAST比对分析表明,在这些序列中都存在明显的"CCGG"二核苷酸成簇富集现象,与MSAP结果一致。     

桑树二倍体及其人工诱导同源四倍体遗传差异的RAPD分析

【目的】从DNA分子水平分析不同桑树二倍体及其人工诱导同源四倍体的遗传差异,为进一步探讨桑树多倍体诱变遗传规律提供理论依据。【方法】利用RAPD分子标记技术,对8个桑树二倍体品种与经秋水仙碱化学诱变获得的同源四倍体进行RAPD多态性和聚类分析。【结果】不同桑树品系二倍体间及与其人工诱导的同源四倍体间的RAPD多态性均存在明显差异。农桑8号和湖桑199号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,诱导未产生变异;湖桑32号的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性最高,达到20.41%,桐乡青、璜桑37号、湖桑197号、国桑20号和育71-1的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性由高到低依次分别为9.09%、6.06%、5.45%、5.17%和3.17%。不同桑树品系间可以分为2大类,其中湖桑32号和桐乡青聚为一大类。【结论】不同桑树品系二倍体经秋水仙碱诱变后产生的遗传差异较大。     

NaCl胁迫下二倍体和同源四倍体西瓜幼苗DNA甲基化差异分析

【目的】研究二倍体和同源四倍体西瓜幼苗NaCl胁迫后形态学指标差异和DNA甲基化变化情况,分析不同倍性西瓜幼苗之间耐盐差异,结合形态学指标从表观遗传学角度解释二倍体和四倍体抗逆性差异机制。【方法】以3组不同倍性（二倍体、四倍体）西瓜幼苗为研究对象,待长至三叶一心时,用含有0、100、200、300和400 mmol·L^-1 NaCl的1/2 Hoagland营养液处理西瓜幼苗,NaCl处理8 d之后,鉴定西瓜幼苗受到的盐害指数,并运用甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术,分析NaCl处理8 d之后二倍体和四倍体西瓜幼苗叶片基因组DNA甲基化水平和模式的变化。【结果】NaCl处理后,形态学指标比较发现,随着NaCl浓度的增加,三组西瓜幼苗的受伤害程度都随着增加,在不同的西瓜品种之间受伤害程度有差异,但是同一品种内同一NaCl浓度下,西瓜幼苗受伤害程度二倍体大于四倍体;从甲基化水平看,西瓜幼苗基因组DNA全甲基化率、半甲基化率、总甲基化率都随着NaCl浓度的增加而降低,同一NaCl浓度处理下甲基化率二倍体大于四倍体,二倍体和四倍体西瓜甲基化水平与其受伤害程度呈正相关;从甲基化模式来看,NaCl胁迫后DNA的去甲基化比率降低,超甲基化比率升高,并且其变化幅度是四倍体大于二倍体,不同倍性西瓜幼苗的甲基化模式与其受伤害程度呈负相关。【结论】NaCl胁迫后西瓜幼苗基因组DNA的甲基化状态发生了变化,并且这种变化与NaCl胁迫程度高度线性相关,西瓜幼苗通过降低甲基化率和降低去甲基化比率来应对NaCl胁迫,四倍体较二倍体有更低的甲基化比率和去甲基化比率,抗逆性四倍体强于二倍体。     

家鸡胚胎发育过程DNA甲基化的MSAP检测

[目的]检测鸡胚不同发育阶段时的DNA甲基化水平。[方法]以不同发育阶段的家鸡胚胎为试验材料,提取基因组DNA,采用甲基敏感扩增片段多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术对其甲基化水平进行了初步检测。[结果]共发现甲基化位点880个,CCGG位点单链外侧的胞嘧啶甲基化位点比例为20．48％,双链CCGG位点的内侧胞嘧啶甲基化19．30％,两者总比例为39．78％。[结论]鸡胚发育过程,DNA甲基化随着胚胎的发育呈升高趋势。     

桑树二倍体及其人工诱导同源四倍亿遗传差异的RAPD分析

【目的】从DNA分子水平分析不同桑树二倍体及其人工诱导同源四倍体的遗传差异,为进一步探讨桑树多倍体诱变遗传规律提供理论依据。【方法】利用RAPD分子标记技术,对8个桑树二倍体品种与经秋水仙碱化学诱变获得的同源四倍体进行RAPD多态性和聚类分析。【结果】不同桑树品系二倍体间及与其人工诱导的同源四倍体间的RAPD多态性均存在明显差异。农桑8号和湖桑199号的二倍体及其同源四倍体间的扩增条带完全一致,诱导未产生变异;湖桑32号的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性最高,达到20．41％,桐乡青、璜桑37号、湖桑197号、国桑20号和育71—1的二倍体及其同源四倍体的RAPD多态性由高到低依次分别为9．09％、6．06％、5．45％、5．17％和3．17％。不同桑树品系间可以分为2大类,其中湖桑32号和桐乡青聚为一大类。【结论】不同桑树品系二倍体经秋水仙碱诱变后产生的遗传差异较大。     

生姜二倍体与四倍体基因组DNA的RAPD和ISSR分析

利用RAPD和ISSR标记对生姜二倍体和四倍体的遗传差异进行研究,结果表明:71个RAPD引物和14个ISSR引物对生姜二倍体和四倍体都扩增出了条带,其中有25个RAPD引物和7个ISSR引物在二倍体与四倍体之间扩增出了差异带,并且86%的ISSR引物序列为(GA)或(AG)的简单重复序列.表明在用一定浓度秋水仙素诱导生姜体细胞染色体加倍过程中,会引起基因组DNA的核苷酸碱基序列的改变,并以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的简单序列重复区间易形成新的结合位点.     

低温胁迫下水稻基因组DNA甲基化的MSAP分析

[目的]研究低温胁迫对水稻幼苗DNA甲基化水平及模式变化。[方法]以水稻幼苗为材料,利用66个不同的引物组合对来自对照(CK)、4℃低温胁迫1 d(T_1)、4℃低温胁迫2 d(T_2)、4℃低温胁迫3 d(T_3)和恢复2 d(T_4)的水稻DNA样品进行甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析,探讨低温胁迫和恢复后,DNA的甲基化水平及模式变化。[结果]甲基化水平分析表明,CK、T_1、T_2、T_3处理样本中总甲基化率分别为37.19%、33.79%、33.67%和32.67%。进一步分析表明低温胁迫处理导致水稻DNA总甲基化水平降低,然而恢复处理组(T_4)减缓了这种趋势。[结论]水稻基因组部分位点的甲基化可能参与了水稻对低温胁迫的响应。     

高粱DNA甲基化变异的分子杂交验证

以2个高粱(Sorghum bicolor L.)亲本纯系及其F1杂交种为材料,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法,对DNA甲基化水平和模式的遗传和变异进行了研究.结果表明:亲本纯系的大部分胞嘧啶甲基化位点稳定遗传给其F1杂交种,但3.94%的位点表现出了变异,即未从亲本遗传给杂交种,并通过Southern杂交方法进一步验证了杂交种和纯系亲本间的DNA甲基化模式的遗传和变异.     

黄芪甲基化敏感扩增多态性(MSAP)扩增引物筛选及初步应用

[目的]建立并优化黄芪甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术扩增反应体系,对中药材黄芪甲基化水平进行研究。[方法]磁珠法提取黄芪DNA后,采用Hpa II/Msp I 2种内切酶进行酶切,将酶切产物加上连接接头序列,经预扩增和选择性扩增反应,最终从黄芪MSAP的256对引物中筛选出最佳分辨引物4对。应用筛选到的4对引物,分析12种不同产地黄芪的甲基化模式,并对甲基化水平聚类分析。[结果]经MSAP检测12个黄芪样本半甲基化率在12.5%~26.7%,全甲基化率在25.6%~51.1%,总甲基化率在48.7%~73.5%,总体上黄芪样本的全甲基化率大于半甲基化率。采用NTSYSpc软件对黄芪样品Hpa II和Msp I多态性数据进行分析,获得UPGMA聚类图和主成分分析PCA图。[结论]MSAP技术能够很好地用于黄芪的甲基化分析,结合NTSYSpc软件能对不同产地黄芪之间甲基化水平进行聚类分析,且初步分析结果表明从UPGMA和PCA图上来看,地区相近的单株聚类分析表现出了一定的地域性。     

丁(鱼岁)养殖群体遗传多样性的ISSR分析

[目的]分析丁[鱼][岁]养殖群体的遗传多样性水平,为其种质资源的评价、保护和合理利用提供依据。[方法]利用简单重复序列区间扩增多态性（ISSR）分子标记技术。[结果]选用77个随机引物对其20个个体的基因组DNA进行PCR扩增,有18个引物可以扩增出稳定且清晰的条带,共扩增出115条稳定的DNA位点,片段大小在100-2000bp,其中多态性位点14个,多态位点比例为12.17％。个体间遗传距离为0-0.1376,平均为0.0329±0.0056。[结论]丁[鱼][岁]群体的遗传多样性水平较低。     

干旱胁迫下复苏植物牛耳草基因组DNA甲基化分析

利用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,研究干旱复苏过程中,牛耳草叶片DNA甲基化水平及动态变化情况.5对引物对共扩增出376个CCGG位点,其中188个位点发生了甲基化或去甲基化变化.处理组总甲基化水平均高于对照组,且均以Ⅰ型CHG(半甲基化)位点为主,占约32.3%~40.2%.牛耳草干旱复苏过程DNA甲基化和去甲基化同时发生,但以去甲基化为主.此外,qRT-PCR技术检测Bh Dnmt2、Bh CMT2等DNA甲基化相关酶基因在干旱复苏过程中的表达,发现均有明显变化.综上,DNA甲基化参与了牛耳草的抗旱复苏过程,可能是通过甲基化/去甲基化调节基因表达,从而参与牛耳草的抗旱分子反应.     

利用ISSR分子标记对25个烟草种质资源的遗传多样性分析

[目的]利用ISSR分子标记研究烟草遗传的多样性。[方法]利用ISSR分子标记对25个烟草种质资源进行了遗传多样性分析。[结果]从50条ISSR引物中共筛选出5条引物,对25份材料烟草基因组DNA进行有效扩增,共扩增出100个位点,其中有76个多态性位点,多态性比率为76.0%。用NTSYSpc-2.10e软件计算烟草种质间的Jaccard遗传相似系数,25种烟草种质之间的遗传相似性系数界于0.313~0.938,平均遗传相似性系数为0.737。野生烟与栽培烟草相似系数较低,说明它们之间存在较高的遗传多样性。利用UPGMA进行的系统聚类分析表明,25个烟草种质资源可划分成2组,3个野生烟聚成一类,22个栽培烟草种质聚成另一大类。[结论]供试栽培烟草的遗传多样性相对较低,迫切需要拓宽栽培烟草的遗传基础。     

桃同株叶片杂色材料的MSAP分析

为探寻桃同株叶片杂色材料PCM-1的突变机制,建立了桃PCM-1G和PCM-1R DNA样品的基因池,用256对甲基化敏感扩增多态性(MSAP)选择性扩增引物进行全基因组甲基化MSAP分析。筛选出23对条带清晰、丰富且重复性好的引物组合。扩增出200~1 000 bp的位点397个,其中PCM-1G、PCM-1R两种类型半甲基化位点分别为38个和44个,分别占全部位点的9.6%和11.1%;全甲基化位点分别为64个和67个,分别占全部位点的16.1%和16.9%;总甲基化率分别为25.7%和28.0%。成功分离了29条甲基化修饰DNA序列,通过测序发现有22条能够得到桃基因组支持且同源性较高,其中2条来自于类胡萝卜素裂解双加氧酶4(CCD4)、3条来自于Omega-羟基棕榈酸阿魏酸转移酶;推测CCD4和Omega-羟基棕榈酸阿魏酸转移酶可能与叶色嵌合突变有关。     

橡胶树MSAP反应体系的建立及其对无性系DNA的甲基化分析

采用改良CTAB法提取橡胶树幼嫩叶片的基因组DNA,通过电泳检测酶切与连接、预扩增和选择性扩增等,建立橡胶树MSAP甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,并利用MSAP技术在基因组水平上对橡胶树幼态优势的形成机理进行研究。结果表明:利用该体系可获得扩增位点多、条带清晰、重复性好的图谱(共扩增出740个条带,404个甲基化位点,平均多态性比例为54.6%),并能有效区分基因组DNA甲基化的状态,为开展橡胶树同一品种不同类型种植材料的表观遗传变异研究奠定了基础。     

河八王杂交种F1、BC1及其亲本DNA甲基化水平和模式变化

为分析河八王及后代基因组DNA甲基化水平和遗传模式变化,以河八王及其后代F_1和BC_1为材料,采用甲基化敏感扩增多态性技术(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)结合毛细管电泳技术(Capillary electrophoresis,CE)分析亲本及后代基因组DNA甲基化水平和遗传模式变化规律。结果表明:母本‘GT05-3256’的MSAP比率是59.6%,父本‘GXN1’则是60.5%,其杂交种F_1的MSAP比率是56.4%～59.0%,均低于双亲;BC_1的母本‘YC94-46’的MSAP比率是59.4%,父本‘T6-3’则是59.0%,BC_1MSAP比率是56.9%～69.8%,整体平均为62.8%,平均值高于双亲。BC_1世代总甲基化水平略高于F_1世代水平。F_1和BC_1基因组CCGG位点发生甲基化的方式整体上以内部胞嘧啶双链甲基化为主。在F_1和BC_1中均检测到70种甲基化类型,并进一步分为A、B、C、D和E等5大类,其中A类是亲本向杂交种的甲基化遗传类型;B类是去甲基化类型,表示杂交种相应于其亲本的甲基化减弱;C类是过或超甲基化类型,表示杂交种相应于其亲本的甲基化增强;D类是次甲基化类型,杂交后代甲基化水平比双亲均要低;E类为不定类型。结果显示,B、C、D、E是杂交种的甲基化变异类型;F_1的甲基化遗传类型(A类)比例明显低于BC_1,但变异类型B、C、D、E高于BC_1;杂交形成F_1和BC_1过程中,基因组DNA普遍发生了超甲基化修饰。     

江苏地区5个三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)种群的ISSR分析

[目的]利用ISSR技术分析江苏地区5个三角帆蚌种群的遗传多样性和亲缘关系。[方法]用10条ISSR引物对5个三角帆蚌种群基因组DNA进行扩增,选取其中5条扩增条带多、信号强、背景清晰的引物对5个群体（无锡太湖、洪泽湖、南京江浦、兴化1、兴化2）共121个个体进行扩增分析。[结果[通过ISSR扩增共获得70个DNA片段,大小在200～2000bp,其中61个位点表现多态性,多态位点比例为87．14％。5个种群的基因多样性指数在0．2599～0．3144,平均值为0．2901,Shannon信息指数在0．3922～0．4663。南京江浦养殖种群的2种遗传多样性指数最高分别为0．3144和0．4663,而无锡太湖野生种群的最低为0．2599和0．3922。[结论]三角帆蚌养殖种群的遗传多样性高于野生种群：5个三角帆蚌种群间的亲缘关系与地理位置无显著相关性。     

盾叶薯蓣品种的ISSR指纹图谱研究

[目的]利用ISSR分子标记构建盾叶薯蓣品种鉴定的DNA指纹图谱,为盾叶薯蓣药材鉴定和良种选育提供技术支持。[方法]筛选ISSR引物,对10个盾叶薯蓣品种进行PCR扩增和电泳检测,统计条带并进行遗传多样性分析、聚类分析等;选择核心引物,建立DNA指纹图谱鉴定体系。[结果]从50条ISSR引物中筛选出9条,对10个品种扩增共得到86条谱带,多态性条带72条,多态性条带比率为83.72%;选出3条ISSR核心引物建立了10个薯蓣品种的ISSR指纹鉴定图谱。[结论]盾叶薯蓣品种遗传多样性丰富;3条核心引物所构建的植物图谱中,每个品种均有各自特异的共有谱带、特有谱带、缺失谱带,这些谱带的组合可用于盾叶薯蓣品种鉴定。