蝉拟青霉类枯草杆菌蛋白酶基因的克隆及其序列和蛋白质分析

蝉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛应用于生物防治。本研究根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉、粉拟青霉、球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3'/5'-RACE相结合的方法,从蝉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease)cDNA基因序列。cDNA全序列为2 031 bp,该序列5'-端和3'-端的非编码序列长度分别为170 bp和262 bp,开放阅读框为1 599 bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为18个氨基酸,前肽长度为133个氨基酸。该基因编码的蛋白序列与虫草棒束孢(Isaria farinosa)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹虫草(Cordyceps militaris)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)类枯草杆菌蛋白酶有较高的同源性,同源性分别为88%、88%、89%和71%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,4个潜在的N-糖基化位点,位于细胞的液泡中与分泌途径相关,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主。     

细脚拟青霉腺苷酸琥珀酸合酶基因的克隆与表达分析

腺苷酸琥珀酸合酶(ADSS)为细脚拟青霉(Paecilomyces tenuipes)有效成分腺苷合成代谢途径的关键酶,而细脚拟青霉中腺苷酸琥珀酸合酶基因Ptadss的克隆与序列分析鲜见相关报道。本文在细脚拟青霉转录组测序结果的基础上,利用PCR技术克隆得到该菌Ptadss基因的cDNA序列,对Ptadss基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析(相关理化性质、结构域、亲水性-疏水性、亚细胞定位、信号肽和高级结构等),并构建PtADSS与相关微生物ADSS的系统进化树。同时,采用实时荧光定量PCR技术,分析Ptadss基因在不同发酵阶段的细脚拟青霉菌丝体中的表达量,以初步明确该基因的表达量对于细脚拟青霉腺苷含量的影响。结果表明:克隆得到的Ptadss基因的ORF序列为1 670bp。该基因编码的蛋白的基本性质为:423个氨基酸残基、相对分子量为46.7 663kDa、等电点(pI)为5.59,含58个磷酸化位点,且该蛋白为定位于细胞质中的非分泌性和非跨膜的疏水性蛋白。结构预测结果表明该蛋白是由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成的复杂结构。序列分析结果提示,细脚拟青霉Ptadss基因与Cordyceps confragosa腺苷酸琥珀酸合酶基因同源性最高,可达91%。结合其他微生物的ADSS氨基酸序列构建系统树,结果表明细脚拟青霉与Cordyceps confragosa亲缘关系较近。另经对不同发酵阶段的细脚拟青霉中Ptadss的表达量及腺苷含量分析结果表明:Ptadss基因的表达水平与菌丝体中腺苷含量存在正相关性。     

粉拟青霉菌剂的研制

粉拟青霉(Paecilomyces farinosus 8318)是油松毛虫(Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu)的致病菌。本文较系统地介绍了温度、光照和营养条件等因素对粉拟青霉孢子产生的影响,菌剂生产的工艺条件,以及此菌对于油松毛虫的毒性。为防治油松毛虫和其它有关农林害虫提供了一种新的微生物菌剂。     

细脚拟青霉液体栽培及氨基酸成分分析

[目的]对细脚拟青霉进行液体栽培研究,并对其氨基酸成分进行分析。[方法]利用马铃薯葡萄糖蛋白胨液体培养基进行液体栽培试验,测定孢梗束产量,并对液体栽培的细脚拟青霉孢梗束和摇瓶培养的细脚拟青霉菌丝体的氨基酸含量进行测定比较。[结果]液体栽培的干孢梗束产量为2.50 g/L;氨基酸分析表明,细脚拟青霉孢梗束的芳香族氨基酸是菌丝体中的2倍,但菌丝体中的人体必需氨基酸、儿童必需氨基酸和甜味氨基酸含量高于孢梗束。[结论]该研究为细脚拟青霉相关产品的开发提供了参考。     

比色法测定细脚拟青霉胞内甘露醇及羟自由基清除率

[目的]采用比色法测定细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率。[方法]以细脚拟青霉为供试菌株,用超声提取法提取细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇,以D-甘露醇为标准品,绘制其标准曲线并计算其回归方程,通过测定甘露醇的吸光度计算细脚拟青霉菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率。同时,测定培养时间和提取时间对菌丝体中甘露醇含量和抗氧化活性的影响。[结果]甘露醇在412 nm处有最大吸收峰,质量浓度在10~80μg/m l范围内其具有良好的线性关系,其回归方程为:C=103.09A-1.381 4,r=0.998 8;平均回收率为101.47%,RSD为2.6%(n=5)。菌丝体中的甘露醇含量及羟自由基清除率的变化趋势基本不随培养时间改变,培养第6天时均达到最高值,分别为73.56μg/m l和47.95%。[结论]为进一步研究细脚拟青霉的抗氧化功能提供理论依据。     

马尾松林生态系中虫生真菌及其寄主的多样性和消长动态的研究

在皖南宣城市敬亭山马尾松林生态系中从山脚至山顶共10个小区内逐月进行虫生真菌全面调查,以分离株数为指标,对2005年2月～2006年5月的球孢白僵菌和几种拟青霉在昆虫群落中的的消长动态进行研究.结果表明,16个月中以白僵菌属占绝对优势,其中球孢白僵菌占总数的54.17%,而多型白僵菌和布氏白僵菌仅分别占0.33%和0.98%.拟青霉属次之,以环链拟青霉为主的3种拟青霉共占43.04%.而绿僵菌属仅金龟子绿僵菌一种,占0.49%.从昆虫寄主的多样性来看,球孢白僵菌和环链拟青霉的Brillouin多样性指数分别为1.89和1.23,均匀度分别为0.61和0.52;粉拟青霉和玫烟色拟青霉的Brillouin指数分别为1.19和0.78,均匀度为0.49和0.32;多型白僵菌、布氏白僵菌和金龟子绿僵菌多样性和均匀度指标较低.不同季节中被球孢白僵菌侵染的寄主昆虫多样性指数呈现出春秋季低、夏季高的趋势,其中7月份最高为1.77;而被环链拟青霉侵染的寄主昆虫多样性指数呈现夏季低、秋季高的趋势,其中10月份最高为1.82;粉拟青霉和玫烟色拟青霉呈现春季高的趋势,在2、3月份最高,分别为1.18和1.54.因此,球孢白僵菌适宜在高温高湿的夏季流行,而3种拟青霉却适应稍低的温度,它们随季节性变化而呈现的不同消长动态,有利于互补地持续控制森林害虫.     

应用粉拟青霉防治松毛虫

本文概述粉拟青霉的形态,生长习性,遗传变异等性状,该菌剂生产,使用方法和安全性以及防治害虫效果,说明粉拟青霉是一种性能良好的杀虫微生物资源,值得开发和推广应用。     

应用粉拟青霉防治南方马尾松毛虫初探

分离于油松毛虫上的粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)经室内测定,在低温下对马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)的杀虫效果优于白僵菌(Beauveria bassiana)。在15℃时,其LD_(50)=1.3×10~6孢子/毫升,LT_(50)=17.5天,幼龄马尾松毛虫比老龄马尾松毛虫对粉拟青霉更敏感。本文还比较了粉拟青霉和白僵菌在不同温度、湿度下约分生孢子萌发率。实验结果表明:粉拟青霉对越冬代的马尾松毛虫的防治具有较大的应用价值。     

虫生真菌粉质拟青霉对黄刺蛾幼虫的致病性研究

报道了粉质拟青霉 (PaecilomycesfarinosusBrown&Smith) 990 5菌株对黄刺蛾幼虫的致病性。研究表明 ,在菌液浓度逐渐增加的情况下 ,黄刺蛾幼虫的死亡率逐渐上升。当粉质拟青霉孢子浓度为 5 0× 1 0 9孢子 /ml时 ,1 0天后幼虫死亡率为 84%。另外 ,从试验结果可知 ,粉质拟青霉 990 5属于偏低温型的虫生真菌 ,适合防治在秋末盛行的黄刺蛾幼虫 ,因此在大面积的果林中应用粉质拟青霉防治黄刺蛾幼虫具有广阔的前景 ,是应用微生物制剂防治害虫的一种有效措施。     

蝙蝠蛾拟青霉新种的研究

从云南采集具有冬虫夏草子座的虫草蝙蝠蛾幼虫体(僵虫)上分离得到蝙蝠蛾拟青霉新种(Paecilomyces hepiali Chen et Dai.sp.nov.)并进行了培养和形态学研究。蝙蝠蛾拟青霉的形态非常接近棒束拟青霉,但两者的分生孢子形态和量度不同,而且该种寄生在蝙蝠蛾科昆虫的幼虫上,故定名为蝙蝠蛾拟青霉。本文报道该菌形态特征。     

万寿菊病虫害的发生与防治措施

万寿菊又名金盏花、臭芙蓉 ,千寿菊、蜂窝菊 ,属菊科万寿菊属一年生草本植物。黑龙江省八五三农场人工栽培万寿菊主要是取其花朵作为提取黄色素的原料。在正常条件下 ,种植万寿菊可实现公顷产鲜花 2 2 .5t以上、产值可达 135 0 0元左右、利润可达6 0 0 0元左右 ,经济效益较好。     

产销通路的建立及招商引资意见

针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见     

水稻病虫害专业化统防统治工作的成效与主要措施

介绍了水稻病虫害专业化统防统治工作的成效、主要措施和今后发展的策略,以期为兴宁市水稻病虫害统防统治提供参考。     

《机械原理》与《机械设计》实验教学改革实践

《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。     

植物学与分子生物学研究创新型实验项目的设计与实施

以农杆菌渗入烟草表皮瞬间表达绿色荧光蛋白的观察实验为例,对植物学与分子生物学研究创新型实验的选题设计、教学过程和效果进行了探讨。该实验项目的实施培养了学生的团队精神、科学素养和创新意识,提高了实验设计和实际操作能力,是生物科学特色专业实验教学改革的有益尝试。     

耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192的筛选、鉴定及酶学性质

为了提高厌氧水解效率,采用双层平板法筛选出一株耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192.经形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),对其产酶条件进行了初步研究.结果表明,该茵的最适生长温度为30℃,生长8～12h达对数期,初始pH 7.5时酶活力最高.蛋白酶最适反应温度为45℃、pH 7.0,酶活力最高达39.3 U/mL.该酶在50℃以下,pH 6.0～9.0性能稳定.在60℃以上热稳定性很差,70℃保存lh酶活力全部丧失.     

干旱和温度胁迫对大蒜生理生化特性及病毒LYSV和OYDV积累的影响

【目的】探明干旱和温度胁迫对大蒜病毒积累的影响.【方法】采用qRT-PCR等方法对干旱和温度胁迫下大蒜叶片生理生化特性以及LYSV和OYDV两种病毒的积累量进行测定.【结果】干旱和温度胁迫下,叶绿素含量、净光合速率和气孔导度显著低于对照(土壤含水量20%,温度22℃),对可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸含量以及SOD活性呈现不同程度的影响;干旱胁迫下,LYSV和OYDV的积累量均随着胁迫程度的增加显著增加,在10%土壤含水量下,LYSV和OYDV分别达到8.60×106和6.54×106;温度胁迫下,低温4℃显著阻止了LYSV和OYDV的积累,高温35℃也对LYSV的积累量(1.78×106)起阻碍作用,而对OYDV的积累量(5.00×106)起促进作用.【结论】干旱和温度对大蒜LYSV和OYDV积累的影响不尽相同,对于其影响机制还需进一步的研究.     

农业科技自主研发的实践与思考

从新农村建设对农业科技自主研发的要求着手,阐述了笔者对农业科技自主研发的认识与思考.在此基础上,提出了农业院校在彰显办学特色过程中如何着力科技创新、不断提高自主科技研发的能力与水平,进一步为新农村建设提供智力支撑的对策思考.     

苦荞的成分功能研究与开发应用

苦荞具有丰富的营养价值 ,它既能食用 ,又能防病、治病 ,为许多其它主要食物所不及。我国有丰富的苦荞资源 ,对苦荞的深入研究和开发应用有利于改善和提高人们的食物结构 ,同时也有助于促进贫困山区的脱贫致富。本文就苦荞的营养价值、药用价值和开发应用等方面的问题进行了阐述     

药食同源蒲公英的开发应用研究现状与展望

蒲公英是一种多年生草本药食同源植物,其富含黄酮、萜类、多糖、绿原酸、果胶等化合物,在临床药用上具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋的功效;同时,蒲公英含有多酚、维生素、矿物质、有机酸、生物碱等活性物质,具有很好的保健食用价值。文章从药食同源的角度对蒲公英的加工应用进行了综述,以期为后续蒲公英的综合开发利用提供参考。