ipt基因转化四季海棠及其抗旱性研究

四季海棠(Begonia semperflorens)的很多栽培品种广泛用于城市绿化,其性状稳定、整齐,观赏效果好,但该植物对水分需求较大。试验对四季海棠再生体系的建立、农杆菌介导的ipt基因转化等进行了研究,获得了抗旱性能提高的转基因植株。通过对所得植株进行PCR以及Southern印迹法检测,证实外源基因ipt已整合到受体基因组DNA。同时,应用ELISA方法检测到转基因植株体内细胞分裂素浓度有明显变化。大田栽培发现,同等情况下转基因植株的耐旱性明显优于对照组非转基因植株。     

水稻醇溶蛋白启动子驱动下的ipt基因表达及对烟草种子iPAs含量和种子重量的影响

将种子特异性表达的水稻醇溶蛋白启动子P与ipt基因融合,构建了pBI121-Pi植物表达载体,通过农杆菌LBA4404介导将基因整合到烟草的基因组中,利用抗生素筛选和PCR检测及序列分析,筛选出转基因的植株,成熟种子通过ELISA试剂盒检测其细胞分裂素含量,发现iPAs的含量为对照的4.17倍,种子的千粒重与对照相比增加了12.14%。     

低温胁迫下转ipt基因水稻某些生理特性研究

测定了特异戊烯基转移酶（ipt）基因水稻EY105的株系T7、T19及对照在低温胁迫下幼苗叶片叶绿素含量、脯氨酸含量及膜保护酶活性。结果表明,常温下,转基因植株除叶片脯氨酸含量比对照低外,所测定的其他生理生化指标没有显著差异;经低温胁迫后,对照植株叶片叶绿素含量降低35．2％,转基因水稻植株基本保持不变,2个转ipt基因的水稻株系脯氨酸含量分别增加60．89％及73．46％,对照植株仅增加11．0％;低温胁迫后对照植株的POD及SOD活性分别下降27．0％及8．3％,MDA增加82．6％,而转基因水稻植株未发生变化。     

超表达水稻MGD基因(OsMGD)烟草植株的耐低磷胁迫能力

【目的】研究超表达OsMGD基因烟草植株在低磷条件下的生长情况,为明确OsMGD基因对植物耐低磷胁迫的影响机理奠定基础。【方法】通过构建表达载体pGWB2-OsMGD和农杆菌介导的转化方法,获得超表达OsMGD基因烟草植株,用磷浓度为5μmol/L的HS营养液对转基因烟草植株进行低磷处理后,研究转基因烟草植株MGD活性、脂质和脂肪酸含量、叶绿素含量、根系鲜质量、根冠比和磷含量的变化情况。【结果】超表达OsMGD基因烟草植株中MGD活性增加了1~3.5倍;在转基因烟草植株中,半乳糖脂(MGDG和DGDG)、磷脂和总脂肪酸含量均显著高于野生型植株,但是转基因烟草植株中的脂肪酸组分与野生型相比无显著差异。低磷处理后,转基因烟草植株的生长情况明显优于野生型植株,转基因烟草植株中叶绿素含量、根系鲜质量和根冠比均显著高于野生型;在正常和低磷条件下,转基因烟草植株中的磷含量与野生型相比无显著差异。【结论】超表达OsMGD基因能增加烟草植株的细胞膜脂含量,使植物体内累积大量半乳糖脂和磷脂,从而提高了烟草植株耐低磷胁迫的能力。     

转OsCYP2基因水稻后代的遗传分析及农艺性状观察

通过对转OsCYP2基因水稻(Oryza stativa L.)吉农大30后代的PCR检测,发现转基因后代中大部分株系分离比率符合3∶1的遗传比率,依此推断该部分植株中插入片段的遗传分离方式符合孟德尔遗传规律;对转基因植株及对照植株(吉农大30)的农艺性状进行观察比较后发现转基因植株的平均穗长、穗粒数、结实率、株高以及千粒重等性状表现低于对照,但是分蘖数明显增加,生育期延长,而且转基因株系之间变异性较大.     

东莞大蕉超表达拟南芥CBF1基因及其抗寒性检测

【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因（AtCBF1）对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出;RT-PCR结果表明,AtCBF1在6个转化系均得到表达,对T1、T2和T3 3个转化系进行RT-qPCR检测发现,AtCBF1基因在3个转基因株系表达水平存在差异;在低温处理下,转基因植株的叶片相对电导率、MDA的累积都低于非转基因植株,而SOD总活性高于对照;低温处理条件下,转基因植株叶片的冷害症状明显轻于对照。【结论】AtCBF1在大蕉中超表达,具有增强大蕉SOD活性,降低因低温导致的MDA含量和离子渗漏率,缓解质膜过氧程度,进而改善大蕉植株抗低温胁迫的能力。     

转TaCRT基因拟南芥植株表型分析及抗性鉴定

为了进一步揭示小麦钙网蛋白基因TaCRT是否参与植物对环境胁迫响应,通过根癌农杆菌GV3101介导法将该基因cDNA克隆转入拟南芥,使其异源过量表达,分析转基因拟南芥纯系和野生型植株在表型上的差异,并对转基因株系的抗盐性进行鉴定。结果表明,过表达TaCRT基因的拟南芥纯系植株在正常培养条件下,植株生长相对旺盛,根系较短,分化的不定根数目较多,而在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的耐盐性较强。     

转ipt基因杂交水稻F1的遗传特性及其主要农艺性状分析

通过对转基因恢复系转ipt R527和金23A杂交后代F1群体的DNA检测,检测到杂种F1群体中阳性植株和阴性植株的比例为7∶1,不符合孟德尔规律;考察了转ipt R527和金23A杂种F1的株高、单株产量、结实率、千粒重、穗长、穗粒数、穗数等7个性状,与对照(金优527)相比,结实率、千粒重、穗长高于对照,单株产量、穗粒数、穗数低于对照,农艺性状间的相关分析表明,千粒重和穗数是影响转基因杂种F1单株产量的重要因素。     

转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性

为提高羽衣甘蓝的抗寒性,本试验将拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,检测转基因株系在4℃低温胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、叶绿素荧光参数(Fv/Fm)和植株存活率。结果显示,在4℃低温胁迫下,转基因植株的P5CS1基因的mRNA过量表达,脯氨酸含量、可溶性糖含量、Fv/Fm和植株存活率均显著高于野生型对照(P0.05),但丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型对照(P0.05)。表明拟南芥P5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的抗寒性。     

过氧化物酶基因PagPRX19对银腺杨‘84K’耐盐性的影响

  目的  盐害作为影响植物生长发育的非生物胁迫因子，严重威胁林木生长。在受到盐胁迫时，植物内源活性氧(ROS)水平增加，造成氧化胁迫，影响植株正常生长发育。因此，可通过增强过氧化物酶PRX家族成员表达水平，改变ROS水平，以增强杨树Populus耐盐能力，揭示PRX成员参与调控杨树盐胁迫响应的机制。  方法  以银腺杨‘84K’ Populus alba × P. glandulosa ‘84K’为材料，生物信息学分析选取PRX家族成员PagPRX19进行克隆并构建过表达载体，农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导叶盘转化法获得过表达植株。以银腺杨‘84K’ PagPRX19过表达植株生长45 d的组培苗和生长2个月的土培苗为实验材料，进行盐胁迫处理，以非转基因植株为对照。观察植株表型，检测脯氨酸、丙二醛、电解质渗透率等生理指标并进行分析。  结果  ①克隆了PagPRX19基因，构建过表达载体，获得转基因阳性植株。经分子鉴定选取2个过表达株系OE#1和OE#2为实验材料做后续分析。②与对照相比，过表达植株株高下降，地径增加。③盐胁迫处理下，过表达植株相较于对照表现为叶片皱缩以及植株生长受到抑制程度低，组培苗的盐胁迫处理表现为相似结果。④转基因植株的ROS水平降低，而且在盐胁迫下过表达植株叶片和根的ROS仍保持较对照低的水平。盐胁迫下过表达植株较对照脯氨酸增加，叶片持水能力增强，丙二醛和电解质渗透率降低。从生理方面显示转基因植株具有较高的耐盐能力。  结论  过表达PagPRX19可降低盐胁迫下杨树转基因植株的ROS水平，缓解氧化胁迫，增强了植株耐盐性。图11参23     

Activity of the photosynthetic apparatus and antioxidant enzymes in leaves of transgenic <Emphasis Type="Italic">Solanum lycopersicum</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Nicotiana tabacum</Emphasis> plants,with <Emphasis Type="Italic">FeSOD1</Emphasis> gene

Introduction of the FeSOD gene enhanced the stability of the photosynthetic apparatus of plants to the action of oxidative stress caused by UV irradiation. The expression of Arabidopsis thaliana FeSOD gene, targeting the enzyme in chloroplasts due to a signal sequence, leaded to significant changes in ultrastructure of cell subcompartments of tobacco and tomato leaves. The activity of superoxide dismutase in leaves of transgenic tomato plants exceeded the value of activity of this enzyme of control plants. Transgenic tobacco plants showed increasing in SOD activity compared with control non-transgenic tobacco. The activity of AP in the leaves of transgenic tobacco and tomato plants was similar with that of control non-transgenic plants, but activity of one accession of transgenic tomato, which is also characterized by high values of SOD activity, exceeded the value of control plant. Differences in ultrastructural organization of chloroplasts in the cells of transgenic and control tobacco and tomato plants have been manifested in a strong enlargement in the size of plastoglobuli. These distinctions were evident especially in the cells of the leaf parenchyma of transgenic tomato as well as transgenic tobacco. Also, a quantity of starch grains in the plastids of guard cells was increased. Chloroplasts in the cells of leaf parenchyma in transgenic plants contained less a starch grains than in wild-type plants.     

茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。     

蔗糖转运蛋白VvSUC11和VvSUC12累加作用对提高转基因甜菜含糖量的影响

【目的】甜菜是重要的糖料作物,块根中的蔗糖含量是其品质的决定因子。利用基因工程技术将葡萄蔗糖转运蛋白基因（VvSUC11和VvSUC12）导入甜菜块根中,以了解蔗糖转运蛋白是否能提高甜菜的含糖量。【方法】利用葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12构建的根特异性表达植物双价表达载体（pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12）,通过农杆菌介导法转化到甜菜（Beta vulgaris L.）品种KWS-9103中。利用PCR和RT-PCR技术检测目的基因是否整合到甜菜中并表达。将获得的转基因甜菜和对照甜菜生根后移栽大田,对其叶片性状、相关的生理指标、块根重和含糖量进行测定。【结果】通过PCR和RT-PCR检测,获得13株转基因甜菜。测得转基因植株叶长、叶宽、叶柄长和叶片数量平均分别为25.16 cm、19.31 cm、29.17 cm和38.33个,与对照相比,叶宽增加31.81%,叶柄缩短16.61%,叶片数目增加17.04%,都存在极显著差异,而叶长增加1.68%,无显著差异;叶绿素a含量（1.31 mg•g-1）、叶绿素b含量（0.562 mg•g-1）和叶绿素总含量（1.87 mg•g-1）与对照无显著差异;叶中可溶性糖含量（14.59 mg•g-1）降低13.04%,与对照（16.51 mg•g-1）存在极显著差异,叶柄中可溶性糖含量（21.90 mg•g-1）增加3.36%,但与对照（21.6 mg•g-1）差异不显著;单株转基因甜菜的块根重和含糖量分别平均为3.067 kg和183.2 g•kg-1,与对照（2.894 kg）相比,块根增重5.91%,差异不显著,含糖量增加9.41%,与对照（167.5 g•kg-1）存在显著差异。说明转基因甜菜叶面积和叶片数的增加,扩大了其光合叶面积,同时叶柄缩短有利于提高糖分子从源叶到库的转运,促进甜菜块根的形成和加快糖分的积累。【结论】利用蔗糖转运蛋白VvSUC11、VvSUC12能够有效地提高转基因甜菜的含糖量。     

转铁蛋白基因水稻抗Fe2+能力分析

[目的]研究转铁蛋白基因水稻对Fe2+胁迫的生理响应。[方法]采用溶液培养法,对参试水稻进行Fe2+胁迫(200 mg/L)处理,测定其株高、生物量、Fv/Fm及质膜伤害。[结果]Fe2+胁迫下,参试水稻生长受到明显抑制,株高和生物量下降,Fv/Fm下降,MDA含量和电解质渗漏增加。与非转基因对照相比,转铁蛋白植株各测定参数受Fe2+胁迫影响较小,差异显著(P0.05)。[结论]水稻中铁蛋白的表达可降低过量Fe2+对植株光合作用的影响和对叶片质膜的损伤,从而减轻Fe2+胁迫对植株生长的抑制作用,提高了植物抗铁毒的能力。     

转Cry1A(b)基因抗虫水稻的获得及鉴定

利用农杆菌混合液介导的共转化法,研究不同浓度的农杆菌混合液浸染5种水稻品种的愈伤组织,进而获得共转化再生植株。对转基因植株进行叶片潮霉素抗性检测和螟虫田间抗性鉴定的结果表明,农杆菌混合液浓度OD600为0.6左右时,其浸染能力较强;5个品种中以浙粳27的再生效率最高。转基因植株叶片经潮霉素抗性检测,潮霉素阳性率为78.13%,经PCR检测转基因植株Cry1A(b)基因阳性率为15.11%。自然抗性鉴定结果表明:Cry1A(b)基因阳性的转基因植株对稻纵卷叶螟具有很好的抗性。基因分离的鉴定结果表明:HPT基因与Cry1A(b)基因在共转化转基因植株的后代中发生了分离。     

转W16小麦抗旱新品系的创制及抗旱生理机制分析

 【目的】培育抗旱转基因小麦新品系,解析转基因小麦抗旱生理机制,为转基因小麦抗旱性鉴定提供依据。【方法】以转W16基因3个高代转基因小麦品系为供试材料,在2008—2010年连续两年大田正常灌溉和干旱处理条件下,对转基因小麦品系进行田间抗旱性鉴定;同时对不同生育期植株体内的脯氨酸和可溶性糖含量及其旗叶的SPAD值进行测定分析。【结果】在干旱胁迫条件下,转基因品系比对照济麦19的单株粒重和千粒重极显著增加,其中单株粒重分别增加20.00%—23.08%、20.88%—24.71%和15.29%—25.27%;千粒重分别增加16.24%—19.85%、13.46%—16.95%和21.58%—24.46%。在正常灌溉条件下,单株粒重分别显著增加7.04%—11.11%、3.52%—8.73%和8.45%—12.70%;千粒重分别显著增加13.57%—14.97%、9.91%—11.67%和14.17%—14.65%。转基因小麦品系的单株粒重和千粒重的抗旱系数在1.15—1.45,抗旱性为强到极强。对转基因小麦的抗旱生理机制分析发现,在干旱胁迫下转基因小麦的根系总长度、根系表面积和根系总体积均显著增加;在灌浆后期转基因小麦品系脯氨酸和可溶性糖含量及旗叶的SPAD值均显著高于受体济麦19。【结论】W16的过表达改善了转基因小麦品系的根系结构、延长了旗叶功能时期,从而增强了转基因小麦对干旱胁迫的适应能力。     

橡胶延伸因子REF基因的克隆、转化及功能分析

取巴西橡胶树新鲜橡胶胶乳,利用改良CTAB法提取胶乳总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中REF基因序列的报道,设计特异性引物,Taq酶扩增,获得REF基因并构建DHN pBin 438-REF植物表达载体。利用叶盘转化法侵染橡胶草无菌幼嫩叶片,通过RT-PCR方法鉴定阳性植株,对其可溶性糖、胶乳和蛋白质含量等进行检测。结果表明,转基因橡胶草可溶性糖质量浓度为0.053 8g/L,约是野生型橡胶草的2倍;橡胶是野生型植株橡胶的1~3倍;而转基因橡胶草中REF基因在蛋白质水平高效表达,其中根和花梗中REF基因高效表达。本研究通过农杆菌介导的遗传转化,获得5株阳性转基因橡胶草植株,分子生物学结果表明,REF基因可在橡胶草中稳定表达,并显著地提高橡胶草中合成天然橡胶的生物量。     

棉花亲环素基因GhCYP1的功能分析

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。     

OsmiR530正调控水稻的耐旱和耐盐性

以粳稻品种日本晴(CK)和农杆菌介导转化的OsmiR530–OE转基因水稻为材料进行耐旱和耐盐性相关功能的鉴定。结果表明：OsmiR530有2种成熟的序列形式OsmiR530–5p和OsmiR530–3p,其表达量在OsmiR530–OE转基因植株均有明显增加;靶基因表达量预测分析发现,OsmiR530–5p的靶基因OsTAP46、OsC3HC4、OsPWI和OsE1等在OsmiR530–OE转基因植株中的表达都有一定程度的下调;在干旱、盐胁迫条件下,OsmiR530能提高种子的发芽率、根长和苗高以及萌芽期幼苗对干旱胁迫和盐胁迫的耐受性;检测干旱处理植株的SOD、POD和CAT活性,发现OsmiR530–OE转基因水稻的SOD、POD和CAT活性增长显著;对成熟期水稻植株的农艺性状进行统计分析,发现过表达OsmiR530水稻植株的剑叶的叶表面积、千粒质量以及结实率显著降低。推测OsmiR530可以调控水稻对盐胁迫、干旱胁迫的耐受性。