甜瓜“Piel de Sapo”TILLING平台的测序

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)即定向诱导基因组局部突变技术,是一种全新的反向遗传学方法,它借助高通量的检测手段,能够快速有效地从化学诱变剂(EMS)诱变的群体中鉴定出点突变。在TILLING技术中,突变位点的测序检测、EMS诱变群体的构建、目的基因及片段的筛选、碱基错配内切酶的选择都是该技术的核心内容。在甜瓜"Piel deSapo"TILLING平台的构建中,PCR产物直接测序和克隆测序2种方法用于检测8个突变家系的碱基变化。在直接测序中,4个突变家系的测序结果清晰,能够确认碱基的变化,其他4个家系的结果不清晰,不能确认碱基的改变。在克隆测序中,8个家系的测序结果均清晰,能够直接确定目的基因的点突变。在2种方法的比较中,克隆测序的准确率、效率明显优于直接测序法。     

TILLING技术在剑麻中的应用前景

定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)技术自诞生以来在多种模式和非模式植物功能基因组学研究中得到了广泛应用,并获得了大量可用于基础研究的突变体材料和可应用于农作物遗传改良的新种质。这种高通量、低成本的反向遗传学研究方法为剑麻研究带来了新的机遇。目前国内外尚无TILLING 技术应用于剑麻研究的报道,而麻类作物亚麻中则已出现 TILLING 技术成功应用的报道。本文将概述 TILLING 技术的特点,对比其在亚麻中的应用,并结合剑麻 EMS 诱变群体构建策略和剑麻基因组学研究进展,综合探讨该技术在剑麻中的应用前景。     

TILLING技术及其在农作物中的应用现状

TILLING技术是一种全新的反向遗传学研究方法。文章简要介绍了TILLING技术的原理、操作流程、技术要点及其特点,并总结了TILLING技术在麦类、玉米及水稻研究中的应用现状。     

CEL I酶的高效检测及其在Eco—TILLING中的高效应用

CELI酶是Eco—TILLING技术的关键酶。实验采用酶切连接的方法构建了酶切位点上插入突变的质粒,应用该质粒能方便有效地检测CELI活性。进一步简化CELI酶的提取方法,并对每一步提取液样品进行活性检测。结果表明,芹菜汁也具有明显的酶切活性,进一步的提纯能提高其活性,琼脂糖凝胶电泳也能获得直观的检测结果,通过简化程序可高效应用于植物Eco-TILLING分析。该研究结果有利于Eco—TILLING技术的广泛使用,对于建立简易而又有效的点突变检测方法具有重要的意义。     

阿维链霉菌aveD基因的定点突变(英文)

[目的]获得aveD基因定点突变株,为阿维菌素的遗传育种提供理论依据。[方法]采用重叠延伸PCR技术对aveD基因进行定点突变,并通过体外酶切连接等分子生物学操作,构建了aveD基因的定点突变载体pDC3(pKC1139∷aveD、),导入阿维菌素(Avermectin)产生菌阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因缺失突变株489中。[结果]经过同源重组,获得aveD基因定点缺失突变株536。测序结果表明突变株536,aveD基因编码区中第69位碱基C突变为T,相应的氨基酸序列第23位由Thr突变为Ile。[结论]该研究为研制生产阿维菌素B的基因工程菌奠定了基础。     

透视极端育种:基因组学在农作物改良中的充分应用

在过去的10年中,基因组学的变革使我们大大加深了对植物生物学的理解,尤其是对模型植物,如拟南芥。同基因组学变革相关的技术,如定向诱导基因组局部突变(TILLING)、基因芯片定位及结合映射,在不远的将来也会被广泛应用于农作物的改良。通过此类研究所获得的决定所期望性状的基因可通过标记辅助育种而加速渗入优良种质。     

一步获取基因定点修饰技术测序样品双峰中突变序列方法的建立

介绍了一种经济高效获取突变序列的方法。该方法克服了传统的基因定点突变样品双峰测序峰图分析工作量大、操作繁琐、结果判定周期长等问题,通过与野生型序列的对比分析,判定突变类型,直接获取突变型基因序列,从而为基因定点突变技术中快速筛选、确定阳性样品及其研究奠定理论基础。     

中国肝细胞癌p53基因热点突变R249S的载体构建及其在细胞中的表达

抑癌基因p53突变是人肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）中常见的现象，中国江苏启东地区的HCC患者中p53基因的第249位密码子突变AGG→AGT/Arg→Ser（R249S）被认为是热点突变。本研究以人肝cDNA为模板，扩增人全长p53基因，将其克隆到pCMV-Myc载体中。利用定点突变引物以pC-MV-p53为模板，构建R249S定点突变体pCMV-R249S，转染p53缺陷型的H1299细胞系。Western Blot检测表明，克隆在pCMV-Myc载体中的p53基因和249位密码子热点突变的p53基因都可以在H1299细胞系中表达。     

大麦TILLING体系在抗病基因研究中的应用

基因组靶向定位诱导损伤技术(Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)是在化学诱变和PCR定向筛选基础上发展起来的检测点突变的反向遗传学研究方法,在多种重要农作物上都有应用。本研究使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)处理大麦品种‘Tamalpais’,获得了2154个M2株系,同时开发了基于芹菜内切酶CEL I(celery juice extract)的酶切筛选体系。针对植物水杨酸抗病途径相关的两个重要基因EDR1和NPR1,检测到5个M2突变株系。序列分析表明,2个突变发生在内含子、1个NPR1基因的同义突变、2个EDR1基因的错义突变(His351Tyr和Pro556Ser)。本项研究为麦类作物反向遗传学研究奠定了基础。     

两端固定梁柱失稳问题的尖点突变模型

应用突变理论建立了两端固定梁柱失稳的尖点突变模型.并利用数学方法,揭示了梁柱失稳过程中平衡的特性.     

TILLING技术研究进展及其在植物空间诱变上的应用前景

在回顾TILLING/ecoTILLING技术的发展及其应用的基础上,阐述了其在植物空间诱变研究领域的应用前景。     

A rapid and cost effective protocol for plant genomic DNA isolation using regenerated silica columns in combination with CTAB extraction

Isolation of high quality DNA from multiple samples can be both time-consuming and expensive. We have developed a combined protocol to reduce the time component of the hexadecyltrimethylammonium bromide(CTAB) extraction method and reduced costs by regenerating the silica columns used to purify genomic DNA. We present data that shows, by increasing the temperature used during the CTAB method, the time required to extract crude genomic DNA can be reduced. We show that silica columns can be regenerated using HCl and still maintain their DNA-binding capacity. Furthermore, we show both spectrophotometrically, and by restriction enzyme cutting, that the quality of the eluted DNA is high. Critically, using both genomic DNA from pea and perennial ryegrass we demonstrate, using species-specific PCR primers, that there is no carry-over of DNA from repeated use of a single column. The main advantages of the method are high yield, high quality, cost effectiveness and time-saving. This method could satisfy demand when large numbers of plant genomic DNA samples are required, for example from targeting induced local lesions in genomes(TILLING) populations.     

基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的棉花EcoTILLING技术体系创建

以棉花纤维发育相关基因GhSUS1为目标基因,从EcoTILLING技术中常用的关键酶CELⅠ的提取、活性检测、目标基因引物设计及酶切等方面入手,开展了棉花EcoTILLING技术体系的创建研究。结果表明:所提取的CELⅠ活性高,稳定性好。在42℃、酶切体系为8μL PCR扩增产物中加入2μL粗酶液,与缓冲液等量混合,酶切45 min,能有效地对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)所在的异源双链错配位点进行酶切。对棉花GhSUS1基因设计A和D染色体亚组特异性引物进行等位基因的多态性分析,结果表明:EcoTILLING结果与测序结果一致,说明建立的基于PAGE的Eco-TILLING技术体系稳定可靠,可用于棉花复等位基因发掘研究。     

植物干旱诱导蛋白研究进展

干旱诱导蛋白是指植物在受到干旱胁迫时新合成或合成增多的一类蛋白。干旱诱导蛋白的差异表达不仅与植物的种类有关,还与干旱胁迫强度、时间及发育阶段等有关。文章从干旱胁迫强度、时间及发育阶段等方面,综述了干旱诱导蛋白的差异表达;介绍了多数干旱诱导蛋白表现出高度的亲水性、很好的热稳定性以及可以被诱导的共同特性;归纳了LEA蛋白、渗调蛋白、水孔蛋白以及抗氧化酶几种主要的植物干旱诱导蛋白的功能特点与研究概况,为对干旱诱导蛋白的进一步研究提供条件。     

寡聚糖激发子对杨树抗溃疡病的诱导作用

【目的】研究寡聚糖激发子对毛白杨愈伤组织抗杨树溃疡病菌的诱导作用。【方法】分别采用筛选出降解杨树溃疡病菌丝体、壳聚糖、果胶糖且活性较高的寡聚糖激发子A1、B、C3诱导毛白杨愈伤组织,以无菌水处理的毛白杨愈伤组织为对照,并在诱导48 h后挑战接种杨树溃疡病菌,测定毛白杨愈伤组织内Vc、可溶性蛋白质和可溶性糖含量的变化。【结果】经A1、B、C3 3种寡聚糖激发子诱导48 h后接种杨树溃疡病菌,毛白杨愈伤组织中Vc、可溶性蛋白质含量的变化基本上呈单峰曲线,A1、B、C3 3种寡聚糖激发子诱导接种的毛白杨愈伤组织中Vc含量峰值比对照峰值分别提高了99.02％,95.46％和85.64％;寡聚糖激发子诱导接种的毛白杨愈伤组织中可溶性蛋白质含量在发病初期（0～48 h）比对照高,在发病后期（60～96 h）均缓慢下降,而对照毛白杨愈伤组织中的可溶性蛋白含量在60 h时上升到最高峰（4.48 mg/g）,均高于3种寡聚糖激发子诱导接种毛白杨愈伤组织,之后急剧下降,至96 h时为2.33 mg/g,比3种寡聚糖激发子诱导接种毛白杨愈伤组织都低;4个处理毛白杨愈伤组织中可溶性糖含量的变化呈双峰曲线,寡聚糖激发子A1、B、C3诱导接种的毛白杨愈伤组织中可溶性糖含量最大值分别比对照的最大值高42.4%,27.6%和16.5%。方差分析表明,A1、B、C3 3种寡聚糖激发子对挑战接种毛白杨愈伤组织中的Vc、可溶性蛋白质和可溶性糖含量均有极显著影响（P<0.01）。【结论】在一定质量浓度范围内,寡聚糖激发子可诱导毛白杨愈伤组织中的Vc、可溶性蛋白质和可溶性糖含量明显提高,从而增强了其抗杨树溃疡病菌入侵的能力。     

利用细胞和组织培养技术研究水稻抗稻瘟病机制

利用组织培养技术建立了水稻悬浮细胞和愈伤组织培养体系.用木聚糖酶激发子处理水稻悬浮细胞,引起细胞内过氧化氢和超氧阴离子含量迅速升高.木聚糖酶和稻瘟病菌提取物处理水稻悬浮细胞1h后,编码几丁质酶的基因Cht-1表达明显增加,而编码病程相关蛋白的PR10基因没有表达,但处理12 h,后者表达明显增加.用稻瘟病菌提取物和激发子木聚糖酶处理水稻悬浮细胞,均诱导水稻细胞合成樱花素--专抗稻瘟病的抗毒素.若用它们处理水稻愈伤组织,则引起组织褐化、生长量降低、密度下降.初步结果表明:水稻悬浮细胞和愈伤组织是研究水稻抗稻瘟病机制方便、合适的实验材料.     

Induced responses to herbivory and increased plant performance

Plant resistance to herbivores was induced in a field experiment to evaluate the consequences of induced responses for subsequent herbivory and plant fitness. Induction early in the season resulted in halving of herbivory by chewing herbivores and a reduction in the abundance of phloem-feeding aphids when compared with controls. A correlate of lifetime plant fitness, seed mass, was enhanced by over 60 percent for individuals that were induced.     

水稻诱导抗病性研究进展

综述了近年来植物诱导抗病性研究的主要进展,介绍了生物因子和非生物因子诱导水稻对病害的作用效果和机制,简述了诱导抗性在水稻病害控制实践中的应用,同时指出了水稻诱导抗性中存在的问题和发展前景。