梨小食心虫雄成虫、蛹和幼虫的转录组比较分析

为挖掘杀虫剂靶标及解毒代谢和抗药性相关基因，利用高通量测序技术对梨小食心虫Grapholita molesta雄成虫、蛹和幼虫进行转录组测序和数据组装，并对转录组数据进行功能注释和比较分析。结果表明，对梨小食心虫雄成虫、蛹和幼虫测序所得高质量reads组装得到195 473个转录本，含有158 206条unigene，其中有71 762条unigene在至少1个数据库中能获得功能注释，有8 186条unigene在所有数据库中均能获得注释，分别占unigene总数的45.36%和5.17%。在GO数据库中共有45 810条unigene的注释划分到56个不同功能区中，鉴定到240个与解毒代谢相关的基因，包括61个羧酸酯酶（carboxylesterases，CarE）基因、38个谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）基因、92个细胞色素P450酶基因和49个ABC转运蛋白基因。雄成虫和蛹之间共注释到262个代谢通路，包括42 143个基因，其中差异表达基因有1 561个；蛹和4龄幼虫之间共注释到232个代谢通路，包括39 127个基因，其中差异表达基因有1 095个；雄成虫和4龄幼虫之间共注释到235个代谢通路，包括41 436个基因，其中差异表达基因有1 582个。选择ABC转运蛋白基因进行深入分析，可划分为8个亚家族；对6个ABC转运蛋白基因进行实时荧光定量PCR验证，显示其表达情况与转录组分析结果基本一致，表明转录组分析结果可靠。     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

温度和光周期对小黑瓢虫滞育的调节作用

在实验室条件下研究了温度（11℃、16℃、21℃、26℃和31℃）和光周期（16L：8D、14L：10D、12L：12D、10L：14D和8L：16D）对小黑瓢虫Delphastus catalinae（Horn）滞育的影响。结果表明,温度、光周期及二者的相互作用均对小黑瓢虫滞育有显著影响。低温和短光照诱导成虫进入滞育。26℃和31℃时,测定的5个光周期均不能诱导滞育;而11℃、16℃和21℃时,滞育率随温度降低或光照时长缩短均呈升高的趋势。11℃和光周期8L：16D是诱导滞育的最适条件。11℃和光周期8L：16D诱导40 d,成虫进入稳定的滞育状态,滞育率高达95.44%。同时发现,滞育成虫产卵前期随温度降低或光照时长缩短而延长。11℃和光周期8L：16D有利于维持滞育,延长成虫产卵前期。21℃和光周期14L：10D加速滞育的解除,缩短成虫产卵前期。     

不同色型异色瓢虫转录组差异表达基因分析

为探究不同色型异色瓢虫Harmonia axyridis之间产生生理学差异的机制,通过Illumina HiSeq测序平台对黄底多窗型、黑底两窗型和黑底四窗型3种不同色型异色瓢虫雌雄成虫的18个转录组进行高通量测序,比较不同色型间的差异表达基因,并结合GO和KEGG数据库对差异表达基因进行注释分析。结果表明：通过对差异表达基因进行定量比较发现,与黄底多窗型相比,2种黑底型异色瓢虫雌雄成虫的下调基因明显更多;GO功能分类结果显示,不同色型的异色瓢虫雄成虫和雌成虫差异表达基因所属分类基本相似,并未见显著富集现象,且主要属于细胞过程、单组织活动和细胞等类别;通过KEGG数据库比对分析发现不同色型异色瓢虫中的差异表达基因功能主要与环境适应和能量代谢通路相关。其中,与氧化磷酸化过程相关的基因在2种黑底型异色瓢虫中的表达量显著低于黄底多窗型异色瓢虫,这种差异在雌成虫中更为显著。     

饥饿胁迫下黑肩绿盲蝽转录组分析及S6K基因功能分析

为扩大黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis的人工繁殖规模,利用RNA-seq技术对饥饿胁迫2 d的黑肩绿盲蝽雌成虫进行转录组测序分析,筛选参与生殖调控的相关信号通路,挖掘直接或者间接影响生殖的相关基因,采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR,qRT-PCR）对筛选的相关基因进行验证,并通过试验分析沉默S6K基因和饥饿处理对黑肩绿盲蝽生殖的影响。结果显示,与取食褐飞虱Nilaparvata lugens卵（CK）的黑肩绿盲蝽相比,饥饿处理2 d的黑肩绿盲蝽雌成虫有11 675个基因差异表达,其中有4 264个基因表达量上调,7 411个基因表达量下调。共筛选到7条与生殖调控相关的信号通路和6个与生殖调控相关的基因,除TSC2基因表达量上调外,其他S6K、INSR、Akt、HSP70-1、HSP70-2五个与生殖相关基因的表达量在7条生殖相关信号通路中均下调。qRT-PCR检测结果与转录组测序结果一致,说明转录组分析结果可靠。沉默S6K基因后,黑肩绿盲蝽雌成虫脂肪体和卵巢蛋白质含量、Vg基因表达量、雌成虫产卵量和Vg含量较对照显著降低。此外,饥饿处理2 d后黑肩绿盲蝽雌成虫产卵量也较对照显著减少。表明饥饿胁迫后黑肩绿盲蝽雌成虫的生殖相关通路可能受多个信号通路调控,S6K表达量下降显著影响黑肩绿盲蝽的生殖。     

光周期对异色瓢虫生殖滞育的影响

为明确光周期对异色瓢虫Harmonia axyridis（Pallas）生殖滞育的影响,于20 ℃条件下测定了13个光周期组合对异色瓢虫滞育率的影响和不同虫态对滞育诱导光周期的敏感性。结果表明：20 ℃条件下,异色瓢虫的滞育临界光周期为6.4 L：17.6 D和11.9 L：8.1 D,光周期10 L：14 D下异色瓢虫滞育率最高为94.2%。异色瓢虫的不同发育阶段对短光照10 L：14 D的敏感性测定表明,成虫阶段对光周期反应最敏感,且成虫羽化后1~4 d对短光照的敏感性较高。结果证实异色瓢虫属于典型的短日照滞育型,成虫羽化初期是感应光周期反应的敏感虫期。     

凹唇壁蜂雌成虫滞育期、休眠期和破茧期肠道菌群多样性分析

为明确凹唇壁蜂Osmia excavata雌成虫滞育期至破茧期肠道菌群的多样性及差异,解析其在宿主健康与调控宿主生长发育中的作用,采用Illumina NovaSeq二代高通量测序技术对不同时期肠道细菌16S rRNA V3~V4区域进行测序,分析雌成虫滞育期至破茧期肠道菌群的多样性变化。结果显示,凹唇壁蜂雌成虫在滞育期至破茧期肠道细菌菌群中共检测到41门96纲198目325科637属,其中核心菌门是变形菌门,相对丰度介于75.98%~91.41%之间;核心菌属是Sodalis,相对丰度介于59.65%~74.66%之间。Alpha多样性分析显示,从滞育期到休眠期,雌成虫肠道内菌群多样性指数明显升高,从休眠期至破茧期,其肠道菌群多样性指数出现降低趋势;休眠期其肠道菌群的物种丰富度和均匀度均最高,滞育期其肠道菌群的物种丰富度和均匀度均最低;Beta多样性分析结果显示,从滞育期至破茧期,其肠道菌群结构相对稳定;LEfSe分析结果显示,从滞育期至破茧期其肠道菌群在门、纲、目、科、属水平均存在显著差异,且差异显著菌群主要出现在休眠期。预测的不同时期的肠道菌群功能不同,这与其成虫解除滞育进入休眠再破茧的生理过程密切相关。表明凹唇壁蜂雌成虫从滞育期至破茧期肠道核心细菌种类一致,群落结构相对稳定,但是群落多样性发生明显变化。     

七星瓢虫乙酰辅酶A羧化酶基因克隆及表达分析

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)是脂肪酸合成第一步反应的限速酶,参与长链脂肪酸的合成。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,探究ACC在滞育七星瓢虫脂代谢中的调控作用。利用RT-PCR和RACE技术从七星瓢虫中克隆得到ACC基因全长,命名为CsACC(GenBank登录号:MT012819),该基因cDNA序列全长7 217 bp,开放阅读框(ORF)长为6 792 bp,编码2 263个氨基酸,预测蛋白质分子量为255.9 kDa,理论等电点(pI)为5.90,无跨膜螺旋结构,无信号肽。通过氨基酸多序列比对分析,结果显示CsACC与鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum乙酰辅酶A羧化酶同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术检测CsACC基因在七星瓢虫正常发育及滞育诱导不同阶段的相对表达量,结果显示,滞育诱导30 d表达量达到最高,滞育诱导60 d、滞育解除期以及正常发育30 d表达量几乎持平。本研究为揭示CsACC基因在脂代谢通路中的调控作用提供理论依据。     

异色瓢虫人工繁育中滞育成虫的冷藏条件

为延长异色瓢虫Harmonia axyridis成虫的货架期,提高规模化生产的灵活度,于室内条件下测定不同温度和光周期对异色瓢虫滞育率的影响、不同温度对异色瓢虫滞育持续时间的影响及不同冷藏温度和冷藏时间对异色瓢虫生物学特性的影响。结果表明,在低温和短光照条件下能诱导异色瓢虫成虫滞育,当温度为20℃、光周期为10 L:14 D时其雌、雄成虫的滞育率均高于95.0%。异色瓢虫的滞育持续时间受滞育诱导温度影响较小,在温度15℃、光周期10 L:14 D和温度20℃、光周期10 L:14 D两种条件下诱导的滞育异色瓢虫在温度25℃、光周期14 L:10 D下均能快速解除滞育,在该条件下饲养10 d时其滞育解除率达90.0%以上。与8℃和12℃冷藏30 d相比,4℃冷藏30 d时异色瓢虫的存活率、总产卵量和捕食量均显著下降;当冷藏温度为12℃,冷藏时间显著影响异色瓢虫雌成虫的捕食量、寿命、产卵前期、总产卵量和卵孵化率,但对雄成虫的捕食量无显著影响。异色瓢虫冷藏期间主要以脂类和糖类作为能量物质,其冷藏期间存活率与相对总脂含量、总糖含量正相关。综上,在实际生产中异色瓢虫可在温度20℃、光周期10 L:14 D条件下诱导滞育,在12℃冷藏90 d不会降低生物适合度。     

斜纹夜蛾四龄幼虫暴食相关基因的鉴定和通路分析

为绿色高效防治斜纹夜蛾Spodoptera litura,采用高通量测序技术对斜纹夜蛾暴食前期（3龄期）和暴食初始期（4龄期）进行转录组测序,筛选暴食前期和暴食初始期斜纹夜蛾差异基因,并对其高表达基因的代谢通路进行KEGG富集分析,随机选择缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路的5个关键基因对其表达量进行测定,以验证转录组测序结果的正确性。结果显示,从转录组数据中共拼接了17 045条unigenes,其中有876条是新发现的unigenes,16 625条unigenes有注释信息;5个基因的实时荧光定量PCR结果与转录组测序分析结果一致,表明转录组分析结果可信;在暴食初始期高表达的基因主要为血淋巴脂多糖结合蛋白基因,暴食初始期高表达基因富集度最大的通路主要为支链氨基酸代谢通路,其次是脂肪酸降解通路,表明暴食初始期斜纹夜蛾在增强其消化系统功能和营养吸收能力的同时,也加强了其能量代谢,为幼虫获取更多的食物提供动力。     

茶足柄瘤蚜茧蜂脂代谢相关的滞育关联基因差异表达分析

本文对茶足柄瘤蚜茧蜂滞育组与正常发育组进行转录组测序,筛选差异表达基因,根据功能注释发现这些滞育关联基因主要与碳水化合物代谢、脂质代谢以及信号转导等途径相关。借助KEGG数据库,共筛选出滞育期间401个与脂代谢相关的差异基因,在滞育期间呈现不同程度的上调表达,涉及了脂肪酸生物合成、甘油脂代谢、类固醇生物合成等代谢途径,除与脂质合成相关的脂肪酸合成酶、超长链脂肪酸延伸酶基因上调表达外,与脂质分解相关的酶,如酯酶同样上调表达,可能与提高茶足柄瘤蚜茧蜂免疫力有关;与激素合成相关基因的上调表达,可能抑制茶足柄瘤蚜茧蜂卵巢发育。     

MEAM1和MED两个烟粉虱隐种取食对甘蓝转录组影响的差异

为绿色防控烟粉虱Bemisia tabaci提供新策略,采用转录组分析MEAM1和MED两个烟粉虱隐种取食后甘蓝差异基因表达情况,并选取差异表达基因最多的甘蓝苯丙烷类通路上PAL2、C4H、4CL1和CHI四个基因进行实时荧光定量PCR测定。结果显示,与对照相比,MEAM1和MED烟粉虱隐种取食后甘蓝差异表达基因数分别为693个和1 030个。GO功能注释和KEGG富集分析显示,差异表达基因主要集中在苯丙烷类生物合成、萜类挥发物合成、芥子油苷合成、类黄酮生物合成和植物激素信号传导途径等与甘蓝抗虫物质合成相关的通路上。虽然MEAM1与MED两个烟粉虱隐种均能显著激活植物激素信号传导途径和苯丙烷类合成通路调控的酚类物质合成途径,但MED烟粉虱隐种与甘蓝互作的差异表达基因数高于MEAM1烟粉虱隐种。MEAM1烟粉虱隐种取食甘蓝12 h后,甘蓝苯丙烷通路上游PAL2、C4H和4CL1三个基因均显著上调,而MED烟粉虱隐种取食后,甘蓝苯丙烷通路上PAL2、C4H、4CL1和CHI四个基因均变化不显著,这4个差异基因的表达模式与测序结果一致,表明测序结果的可信度高。     

云杉花墨天牛转录组分析及其生物防治相关基因筛选

为明确云杉花墨天牛Monochamus saltuarius的基因组功能信息，并筛选其生物防治相关基因，利用Illumina Novaseq 6000平台对云杉花墨天牛成虫进行转录组测序和生物信息学分析，并在NR、GO和KEGG数据库进行基因功能注释。结果显示，共获得190.06 Gb的云杉花墨天牛有效转录组数据，得到35 728个unigene，平均长度为1 270.83 bp，组装得到58 142个转录本，N50长度为2 135 bp。所得unigene在NR数据库中比对注释到相似基因数量占比最高的物种为光肩星天牛Anoplophora glabripennis，达到63.83%，在GO数据库中按功能注释分为生物学进程、细胞组分和分子功能3大类60个亚类，在KEGG数据库注释到44条代谢通路中。根据基因注释信息进一步挖掘出具有生物防治潜力的嗅觉相关基因43个、蜕皮相关基因149个、几丁质代谢相关基因35个、飞行相关基因6个和木质纤维素相关基因39个，可作为后期开发新的分子工具和云杉花墨天牛生物防治技术的备选靶标基因。     

有翅型和无翅型小麦禾谷缢管蚜转录组差异分析

为有效防控有翅型小麦禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi,以浙江省小麦主要害虫禾谷缢管蚜为研究对象,比较分析其有翅型和无翅型转录组之间的差异,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行功能注释和代谢通路分析,采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR,RT-qPCR）技术对转录组测序结果进行验证。结果显示,经过StringTie软件组装,共获得39 699条unigenes。注释到NCBI-NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG六个数据库中unigenes数量分别为24 120、17 351、17 137、17 532、15 494和23 128条,分别占unigenes总数量的60.76%、43.71%、43.17%、44.16%、39.03%和58.26%。有翅型和无翅型禾谷缢管蚜之间共筛选到6 747个基因差异表达显著,其中289个基因上调表达,其他6 458个基因下调表达,大多数差异表达基因集中在糖代谢及氨基酸代谢等信号通路上,表明禾谷缢管蚜翅型分化可能与能量分配有关。UGT、MME、GST和ABCG14四个基因的RT-qPCR测定结果与转录组测定结果一致,表明转录组测序数据准确可信。     

基于转录组测序解析干旱胁迫对祁连山黄参基因表达的调控

以栽培2个月的黄参为试材,设置对照（土壤相对含水量70%~80%）和适度干旱胁迫（土壤相对含水量55%~60%）处理,利用高通量转录组测序BGISEQ-500平台,对测序结果进行基因功能注释、差异表达基因(DEGs, differentially expressed genes)筛选。结果表明：(1)获得的68193条Unigene中,分别有34230(50.20%)、34170(50.11%）、31727(46.53%)、27701(40.62%)、27092(39.73%)和22793(33.42%)个Unigene分别被分配到NCBI非冗余蛋白(NR)、eggNOG(基因的进化谱系, Evolutionary genealogy of genes: Non\|supervised Orthologous Groups)、基因本体(Gene ontology,GO)、Pfam (Protein family)、SwissProt (Reviewed protein sequence database)和KEGG (Kyoto encyelopedia of genes and genomes)六大功能数据库。(2)DEGs分析显示,黄参块状根和叶中分别有10674个和13402个DEGs;GO富集结果表明,根和叶中的DEGs功能部位中的分布基本一致,主要富集在生物过程、DNA的复制和翻译调控、氧化还原过程、蛋白质磷酸化、防御响应等;KEGG富集分析表明,根中DEGs显著富集在苯丙烷类生物合成、半乳糖代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、植物-病原菌相互作用、植物激素信号转导等途径,叶中DEGs则主要富集在半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成、戊糖、葡萄糖醛酸转换、植物激素信号转导等途径,说明淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、苯丙烷类生物合成途径、植物激素信号转导途径在黄参应对干旱胁迫中起重要作用。干旱胁迫影响黄参不同器官中差异基因的表达,为解析黄参耐受干旱的生物学途径、黄参药效成分的生物合成和分子机制提供了理论依据。     

水分胁迫下水稻对褐飞虱转录组的影响

为明确褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)在稻田缺水条件下的发生和灾变规律,以感虫水稻品种TN1为材料,以取食无水分胁迫水稻的褐飞虱为对照组,取食水分胁迫(以15%PEG6000营养液处理48 h模拟)水稻的褐飞虱为处理组,采用Illumina转录组测序技术研究水分胁迫下水稻对褐飞虱转录组的影响。结果显示,测序序列经拼接后得到褐飞虱全部单基因unigene共47 335条,平均长度为1 234 bp;与对照组相比,处理组中表达量差异显著的基因共有1 331条,其中表达量上调的基因有712条,表达量下调的基因有619条;随机选取20条具有显著表达差异的基因,通过实时荧光定量PCR方法检测其表达量以进行验证,其中有13条基因的表达量与测序结果变化一致。对差异表达基因进行GO注释和KEGG代谢通路功能富集分析表明,能量代谢和水分代谢相关通路在水分胁迫处理的褐飞虱中显著富集,表明这几类基因在褐飞虱应答水分胁迫中发挥了重要作用。     

烟蚜茧蜂滞育关联基因的转录组学分析

烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis Ashmaed是一种优良的内寄生性天敌昆虫,可有效控制桃蚜等多种蚜虫为害。通过调控温光环境可诱导烟蚜茧蜂进入滞育,既能提升子代烟蚜茧蜂的适应能力和寄生能力,又能显著延长天敌产品的货架期,促进天敌昆虫在害虫生物防治中的应用。本文通过对烟蚜茧蜂的正常发育状态(ND)、滞育状态(D)及滞育解除状态(PD)进行RNA测序,改变并丰富了以往仅对正常和对照组进行分析的常规做法,重点研究只在滞育状态才特异表达、而在正常发育和滞育解除后无显著变化的转录组学波动规律。经分别构建正常发育、滞育、滞育解除样本组,再经RNA提取与纯化,c DNA合成,c DNA文库构建,文库质检合格后进行de novo双端测序,根据对9个样本的测序结果,获取unigene 40477个,获得ND组与D组差异表达基因458个,D组与PD组差异表达基因298个,进一步筛选出D组与ND及PD组显著差异、但ND组与PD组无显著差异的滞育关联基因59个,对后者进行了GO富集、KEGG通路富集等表达分析,根据功能注释发现这些滞育关联基因与自身防御、耐寒性、脂类代谢、表皮黑化、转录调控等途径相关,是影响烟蚜茧蜂滞育进程的重要调控和参与基因。     

沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇头部转录组的影响

为明确沃尔巴克氏体Wolbachia对果蝇神经行为影响的分子机制,采取转录组测序技术对感染沃尔巴克氏体和未感染的黑腹果蝇Drosophila melanogaster头部样本进行转录组测序、组装、注释,筛选感染沃尔巴克氏体wMel和未感染黑腹果蝇头部转录组间的差异表达基因,并选择差异表达基因中差异倍数较大或与神经行为相关的基因进行qPCR验证。结果表明,感染沃尔巴克氏体wMel和未感染黑腹果蝇头部差异表达基因有679个（差异倍数≥2,P<0.05）,其中,由于感染沃尔巴克氏体wMel而上调表达的基因有566个,下调表达的基因有113个。GO功能注释分析显示,差异表达基因与代谢过程、催化和结合功能相关。KEGG通路注释分析发现,差异表达基因主要富集在蛋白消化与吸收、内分泌、神经活性配体-受体互作以及激素合成等通路中。从差异表达基因中筛选出11个基因进行qPCR验证,有9个基因的表达趋势与RNA测序结果一致。表明沃尔巴克氏体可广泛影响果蝇头部基因的表达水平,暗示可能由此影响宿主的神经行为。