红麻叶绿体DNA非编码区扩增及PCR-RFLP多态性分析

为研究红麻叶片叶绿体DNA(cpDNA)非编码区的序列特征,采用改良CTAB方法提取红麻总DNA,以8份红麻光钝感突变体及其4份近缘种基因组DNA为模板,应用8对植物cpDNA通用引物对红麻cpDNA非编码区序列进行PCR扩增,优化cpDNA非编码序列PCR的扩增条件,应用4种限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ、TaqⅠ、AulⅠ)酶切扩增片段.结果表明:所筛选的通用引物适用于红麻cpDNA非编码序列扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测,片段大小为400-2000 bp,共扩增cpDNA片段大小约13000 bp.将PCR扩增产物进行酶切,每个片段均有相同的酶切位点,只有cp4引物对cpDNA的扩增产物经AluⅠ酶切获得多态性片段,红麻光钝感突变体及其对照的cpDNA存在部分变异,该结果可为进一步探讨红麻叶绿体基因组种内的变异情况提供理论依据.     

适于PCR-RFLP分析的吊兰DNA提取

为了提取适合于PCR-RFLP分析的高质量的吊兰DNA,采用改良CTAB法提取了南阳市常见的宽叶吊兰、金边吊兰、金心吊兰的基因组DNA.通过测D_(260nm)/D_(280nm)检测了所得DNA的纯度及浓度.以所得3种吊兰DNA为模板,以植物中常用的通用引物trnH-trnK扩增了3种吊兰叶绿体中的基因及基因间隔区,并把所扩增的PCR产物用限制性内切酶Sau3A Ⅰ进行了酶切.结果表明,用该方法获得的吊兰DNA纯度高,D_(260nm)/D_(280nm)多在1.7～1.9之间,且电泳条带清晰,无拖尾,无降解,用作模板能扩增出目标产物,适合于吊兰的PCR-RFLP分析.     

利用PCR-RFLP技术鉴别异尖线虫

应用PCR-RFLP技术对福建沿海海鱼中常见的简单异尖线虫、典型异尖线虫、对盲囊线虫和针蛔线虫幼虫进行鉴定.采用通用引物扩增上述4种异尖线虫幼虫的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列,对PCR产物进行回收、克隆和测序.根据序列分析结果,选用限制性内切酶HinfⅠ和RsaⅠ进行酶切,酶切产物经琼脂糖电泳分析.结果表明:同时使用HinfⅠ和RsaⅠ酶,可以将4种异尖线虫进行分类;应用特异性引物扩增这4种异尖线虫,获得了预期扩增片段.可见,根据4种线虫ITS序列建立的PCR-RFLP技术能够对这4种异尖线虫进行准确、特异和快速的鉴定.     

黑龙江省南瓜疫病菌遗传多样性分析

试验利用通用引物ITS1和ITS4对南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)的19个菌株的ITS rDNA进行扩增,然后利用4种限制性内切酶酶切PCR扩增产物,分析各菌株间的DNA限制性片段多态性。运用ITS通用引物在所有供试南瓜疫病菌菌株上均可扩增到一条长为575bp的特异DNA片段。经限制性内切酶酶切和聚类分析,将黑龙江省南瓜疫病菌可划分为4种病原型。运用一对ITS通用引物扩增供试菌株得到20个ITS标记,其中多态性标记占95%。供试菌株在遗传上有相似性,差异也非常明显,表明南瓜疫病菌群体内部存在着丰富的遗传多样性。     

两种滑刃亚目线虫的ITS-PCR-RFLP研究

采用ITS区通用引物对阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus arthuri)和燕麦滑刃线虫(Aphelenchusavenae)的基因组DNA进行PCR扩增,对其PCR扩增产物进行序列测定分析,同时用5种限制性内切酶(RsaⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和AluⅠ)对PCR扩增产物进行酶切,得到相应酶切图谱。两种线虫的DNA序列测定分析以及ITS-RFLP酶切图谱得到的鉴定结果与形态鉴定结果一致。试验得到的阿苏里伞滑刃线虫和燕麦滑刃线虫ITS-RFLP酶切图谱可以为线虫的分子鉴定提供参考。     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

土生空团菌(Cenococcum geophilum Fr.)的菌种鉴定及其遗传多样性的初步分析

 【目的】鉴定外生菌根真菌土生空团菌（Cenococcum geophilum Fr.（Cg））菌种，分析土生空团菌的遗传多样性，探讨影响土生空团菌遗传分化的因素。【方法】采用形态特征结合PCR方法，从分离自6种寄主植物的27个中国菌株和来自法国的5个Cg菌株中鉴定出20个Cg菌株。利用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和随机扩增片断多态性DNA（RAPD）两种分子标记方法对这20个Cg菌株进行遗传多样性分析。【结果】PCR-RFLP方法以通用引物ITS1和ITS4对20个Cg菌株的核糖体DNA转录间隔区（ITS）进行了PCR扩增，扩增产物用3种内切酶（EcoRⅠ、HinfⅠ和MboⅠ）酶切，酶切图谱显示菌株间有明显差异。RAPD方法用经过筛选的随机引物（5'-CGCACCGCAC-3'）对20个菌株的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物的片段大小在300～2 000 bp范围之间，共产生19个多态性位点。根据电泳图谱上DNA带的数目、位置及强度进行数值化，用聚类分析软件计算菌株间的遗传距离和遗传相似性，根据遗传距离构建20个菌株的系统聚类图。【结论】来源于不同寄主及地域的20株Cg有着较丰富的遗传多样性；地理环境和寄主对Cg遗传多样性的影响不大。     

运用PCR-RFLP标记检测南瓜疫病菌

用 1对特异引物对南瓜疫霉菌 (Phytophthora capsici)及疫霉属 (Phytophthora)部分真菌和常见土传真菌12个种的 14个菌株的 18s r DNA(即 Small Subunit Ribosom al DNA)进行扩增 ,用 4种限制性内切酶 (Eoo R 、Hae 、Hha 、Hinf )酶切 PCR扩增产物 ,分析各菌株间的 DNA限制性片段多态性 ,首次建立了南瓜疫霉菌的PCR- RFL P检测程序。并运用该 PCR- RFL P检测程序对染病南瓜植株进行检测 ,成功地在南瓜植株发病茎病健交界处、发病叶病健交界处、发病果病健交界处、接种 2 4 h的叶和接种 P.capsici 12 h的茎上快速、准确地检测到了南瓜疫病菌的存在。     

我国南方常见的6种寡毛实蝇PCR-RFLP快速鉴定研究

应用PCR—RFLP技术，对我国南方发生和诱捕到的6种寡毛实蝇开展了快速鉴定方法研究，结果表明，设计出的2组引物对6种供试实蝇线粒体DNA(mtDNA)的PCR扩增片断大小分别约为350bp和450bp。用限制性内切酶MSEI和DRAI对PCR扩增产物进行酶切，得到的酶切位点可将供试的6种实蝇区分开来。该方法不受供试实蝇食物源的影响，对各种虫态(卵、幼虫、蛹)和不同性别的成虫均适用，可用于实蝇的快速鉴定。     

水稻土细菌群落结构的RFLP分析

采用直接提取土壤微生物总DNA的方法,提取苗期水稻根际土和非根际土土样微生物总DNA.用细菌通用引物扩增16S rDNA基因片段,建立克隆文库.用限制性内切酶HhaⅠ进行PCR-RFLP分型,分别得到113个和110个酶切类型.采用多样性指数和优势细菌聚类比对方法对试验结果进行分析统计.结果表明,根际水稻土细菌的种属多样性指数、丰富度指数、均匀度指数比非根际土略高;在水稻根际土和非根际土中的优势细菌种群分别有3 种具有完全相同的酶切类型,其余间存在一定的差异.     

猕猴桃AFLP分析体系的建立及其组培变异苗的动态检测

为减少猕猴桃组培过程中变异苗带来的损失,对‘Hort 16A’猕猴桃组培继代苗进行AFLP动态监测。通过试验建立了猕猴桃基因组DNA多态性的AFLP分析体系,并对R7 R11五代75个样本进行遗传多样性分析。研究结果表明：AFLP分析体系DNA最适用量为300 ng,内切酶最适用量为1 U,酶切最适时间为4 h,T4 DNA ligase最适用量为1 U,adpter最适用量为15 μL,ATP最适用量为2 μL,预扩增引物（100 μmol·L-1）最适用量为08 μL,选择性扩增Taq酶最适用量为025 μL （5 000 U·mL-1）,筛选出条带数最多的引物有8对。在遗传多样性分性中,共得到494个条带,其中多态性条带为310条,多态性比例为627%。猕猴桃组培苗继代到第9代还能较好地保持基因遗传稳定性,从第10代开始,变异率随着继代次数的增加呈明显上升趋势。     

家猪AFLP分析体系的建立

以大白等6个猪品种为试验材料，建立了家猪扩增酶切片段长度多态性(AFLP)分析体系，对其分析过程中DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染效果进行了检测。用E39M48引物组合构建了供试猪的AFLP指纹图谱。条带清晰可辨，扩增信号强，无背景干扰。     

改良CTAB法提取薰衣草基因组DNA研究

[目的]寻找高效、快速的薰衣草（Lavandula pedunculata）基因组DNA提取方法。[方法]通过改良CTAB法提取薰衣草3个品种的基因组DNA。[结果]经检测,所提样品OD260/OD280值在1.85左右,得率为454.50～1 093.35μg/ml,电泳条带清晰,无明显的拖尾现象;Eco RI酶切基因组DNA图谱表明,提取的DNA能被限制性内切酶完全酶切;以提取的DNA为模板,用1对随机引物进行RAPD-PCR,发现检测条带清晰,说明获得的DNA质量较高,可以满足相关的分子生物学研究需要。[结论]该研究可以为薰衣草分子生物学的后续试验的开展奠定理论基础。     

利用AFLP技术筛选与哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)性别相关的分子标记

利用AFLP技术,分析比较雌雄哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)之间的遗传差异。采用两个酶切组合,共45对引物组合对雌雄个体进行扩增。结果表明,电泳检测条带清晰丰富,两个酶切组合分别扩增出958和971个位点,多态性比例分别在4.76%～62.26%和6.98%～37.50%,15个位点在雌雄个体中的比例存在很大差异,聚类分析结果显示雌鱼聚在一起,雄鱼聚在一起,未发现雌雄特异位点。研究积累了大量AFLP分析数据,可为哲罗鱼性别的进一步研究奠定基础。     

燕山板栗叶片基因组AFLP反应体系建立

该文以燕山板栗嫩叶为材料,利用改良的CTAB法提取高质量的总DNA,通过优化了酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱.研究结果表明:① 应用经过改良的CTAB法可获得用于构建板栗AFLP体系的高质量DNA;②单独酶切和单独酶连体系比酶切酶连共体系效果更好,确定了板栗基因组DNA AFLP分子标记反应体系;③在所分析的9种引物组合中EAAC＋M-CAA、E-AAC＋M-CAT和E-AGT＋M-CAT 3个引物均获得较好的多态性.其中以E-AGT＋M-CAT引物对组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,得到了稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带.      

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

部分鸢尾属植物的AFLP标记

利用AFLP技术,选择EcoRI/MesI酶切组合,从48对EcoRI,3/MesI+3引物组合中筛选出6对引物进行选择性扩增,检测了鸢尾属植物26个样品基因组的DNA多态性,共扩增出536个遗传位点,并通过Jaccard的方法将电泳谱带矩阵转化为遗传相似性系数矩阵,进行了UPGMA聚类分析.26个样品的遗传相似性系数...     

栽培稻与Oryza officinalis相似群野生稻基因组VDAC基因的比较

根据水稻基因组文库日本晴的基因组VDAC基因的序列,设计引物分别扩增6种不同基因组的野生稻(BB、CC、BBCC及CCDD)和2种栽培稻(AA)的基因组DNA的VDAC基因片段.所有分别代表8个VDAC基因的8对引物中,除引物VDAC3外,其它7对引物均能扩增出预期大小的特异条带,其中一些片段是所有试验材料共有的,而另一些则具有明显的基因组或种的特异性.AA、BB、CC基因组均具有VDAC1、VDAC4、VDAC7和VDAC8引物的扩增位点,而DD基因组则不能确定.VDAC6的引物位点是AA基因组所特有.VDAC2引物的扩增位点存在于基因组AA、BB、DD,而CC基因组中则无此位点.而VDAC5则可区分同为CCDD的宽叶野生稻和高秆野生稻.栽培稻种与野生稻种基因组相比能扩增出更多的VDAC基因片段的试验结果,为进一步研究稻属中VDAC基因的起源及进化关系提供了基础.