鸭瘟病毒ZJ2016强毒株部分基因序列的测定与分析

2016年,浙江省一鸭场发生疑似鸭瘟病例,经鉴定,病鸭感染鸭瘟病毒,命名为ZJ2016病毒株。实验应用二代基因测序方法对该病毒核酸进行全基因测序,鉴定分析鸭瘟病毒ZJ2016株抗原与毒力相关基因序列特征。对测序病毒主要囊膜糖蛋白基因gB、gC、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN与致病力基因LORF11、UL2、UL12、UL41、UL47、US10进行核酸与氨基酸序列分析,并与已发表毒株序列及疫苗株(VAC株、clone-03株)序列比较。结果显示,与疫苗免疫保护抗原相关的ZJ2016株囊膜糖蛋白序列与疫苗毒株序列相比未发生明显的变异,而ZJ2016株的LORF11、UL2、UL12、UL41、UL47、US10基因结构及同源性与疫苗株氨基酸序列差异明显,且与中国其他分离强毒株LH2011株、CHv株、CV株同源性较高,表明该毒株具有强毒株的基因型特征。     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。     

crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。     

马立克氏病毒强毒株攻击免疫鸡群的诊断

为准确诊断发病鸡群的发病情况.对检测样本进行流行病学和血清学调查、病理组织学观察以及基于马立克氏病毒1型(MDV-1)长独特区内部重复序列132bpr基因合成特异性引物,扩增MDV-1的该重复序列.结果表明:该免疫鸡群受到了MDV强毒攻击,发生了马立克氏病.     

中国马传染性贫血病毒驴强毒株感染性分子克隆的构建

 马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）驴强毒株DV是一株经过驴体传代获得的而具有超强毒力的毒株，对马和驴均可100％致死。用PCR方法分段扩增了DV其前病毒基因，将包含全基因片段的3个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到pLG338上，命名为pD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞，连续盲传3代并以反转录酶活性测定，RT-PCR鉴定其病毒活性，透射电镜观察发现细胞培养物中存在大量典型病毒粒子，证明获得了1株具有感染性的EIAV病毒粒子，命名为pD70344V。经序列测定确认了本试验首次构建了1株完全来源于EIAV强毒基因的感染性分子克隆，将此克隆病毒接种驴，可以引起典型的马传贫症状并导致试验动物死亡。该分子克隆的建立为进一步考察病毒的毒力与基因的关系提供了良好的平台。     

牛支原体蛋白质组学双向电泳技术的建立及初步分析

为了建立M.bovis蛋白质组学技术,试验采用M.bovis湖北分离株为实验材料,对样品处理、固相pH梯度胶条、上样量及染色等影响双向电泳图谱质量的关键因素与环节进行一系列的探索,2D Clean-up试剂盒处理的样品400μg在13 cm干胶条(pH 4~7)中进行双向凝胶电泳,考马斯亮蓝R350染色的方法,结果获得了能较好展示大部分蛋白点,分辨率及重复性均很好的双向电泳图谱,应用Image Master 2D Platinum version 6.0软件对图谱进行初步分析,不同重复图谱之间的平均匹配率达80.95%,随机取重复性好的20个蛋白点进行质谱分析,获得19蛋白质点的肽质量指纹图谱,鉴定成功率为95%。质谱鉴定结果与自建M.bovis蛋白库对比,蛋白点匹配率高于82分值限值(P<0.05)的不同蛋白有12个,初步分析这些蛋白多为酶类。说明该技术平台能有效用于M.bovis蛋白质组学的后续研究之中。     

布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较

为比较不同布鲁氏菌血清学检测方法的性能差异,本研究采用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）、布鲁氏菌抗体快速检测试剂卡（GICA）4种常规血清学检测方法,分别对感染情况已知的87份羊血清（阳性53份,阴性34份）进行血清学检测,进而比较4种方法的敏感性、特异性与一致性。检测结果显示,BT的敏感性、特异性较为一般;GICA的敏感性较好,特异性一般;SAT与cELISA的敏感性、特异性较为良好。RBT与GICA的酸性检验结果（Kappa值）均小于0.81,与真实结果一致程度为高;而SAT与cELISA的Kappa值均大于0.81,与真实结果一致程度为极高。在临床诊断中推荐选用RBT与GICA作为初筛检测方法,对初筛检测结果为阳性的样本,结合临床症状,采用SAT与cELISA进行复核。     

猪种布鲁氏菌2号苗在猪体上免疫实验的研究

猪种布鲁氏菌2号苗（S#-2）是中国兽药监察所培育出的一株弱毒疫苗株。目前在世界上还没有好的疫苗预防猪的布鲁氏菌病的情况下,应用S#-2进行了实验性研究。结果表明,给怀孕猪皮下接种500亿S#-2活菌,给性成熟公猪肌肉内接种700-1500亿活菌,分别在猪体内连续通过5代,毒力没有增强,也不会造成怀孕猪流产。怀孕猪免疫接种S#-2第70天,攻击强毒,在对照猪70-87.5%感染的情况下,免疫组80-90%猪获得保护。公猪皮下接种186亿活菌,经测定,S#-2在猪体内停留时间小于60天。猪皮下接种S#-2后有轻微全身反应,1-2天后恢复正常。口服S#-2几乎没有任何副作用。无论采用注射或口服途径给猪接种,大约在35天补体结合反应转阴而凝集反应仍为阳性,据此,可以对免疫猪和感染猪进行鉴别诊断。布鲁氏菌2号苗毒力稳定,对各种动物都具有良好的免疫原性,用口服方法接种不会造成怀孕动物流产。本文综述了猪种布鲁氏菌2号苗在猪体上进行的免疫实验研究。     

一株中等毒力牛种布鲁氏菌的鉴定和毒力测定

【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株（B. abortus 343）进行全面的生物学特性检定,为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B. abortus 343划线培养及梯度稀释,使其形成单个菌落,观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色,观察其染色特点;分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾（1﹕25 000）或含碱性复红（1﹕25 000）的TSA平板上,观察其生长状态;将接种有B. abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅试纸条测定B. abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试验测定布鲁氏菌单相特异性血清（ 牛种布鲁氏菌单因子血清A、羊种布鲁氏菌单因子血清M 和 布鲁氏菌粗糙型血清R ）与B. abortus 343抗原的反应性;利用布鲁氏菌AMOS-PCR种属分型等方法对B. abortus 343进行了PCR种属特性鉴定;将B. abortus 343免疫小鼠,分别测定其抗血清与光滑型和粗糙型抗原的反应性;通过小鼠和豚鼠感染试验,全面评价该分离株的毒力;分别以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,测定B. abortus 343在小鼠体内存活时间;以1×109 CFU感染Hartley豚鼠,2周后测定试验豚鼠每克脾脏含菌量;分别以10 000、1 000、100、25 CFU/只4种不同剂量感染豚鼠,初步测定分离株对豚鼠的最小感染量（MID）,在此基础上,进一步以40、60和90 CFU/只测定MID。【结果】分离株B. abortus 343 为光滑型牛种布鲁氏菌,菌落逆光观察微带蓝绿色乳光;革兰氏染色为阴性,柯氏染色为红色,H2S试验阳性。该菌能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长,不依赖于CO2。B. abortus 343抗原能与A因子血清呈明显凝集反应,免疫小鼠后能产生特异性抗体。以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,可在小鼠体内存活29周;以1×109 CFU感染350-400 g雌性豚鼠,14 d后豚鼠每克脾脏含菌量2.4×105-1.2×106;以1×105 CFU感染豚鼠1个月后,所有试验豚鼠均能产生特异性光滑型抗体,试管凝集效价为320-1 280;B. abortus 343对豚鼠的最小感染量约为40 CFU。【结论】鉴定了一株中等毒力牛种布鲁氏菌（B. abortus 343）,为深入研究布鲁氏菌病提供了参考菌株,丰富了布鲁氏菌菌种资源。     

3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

为了筛选适用于家畜布鲁氏菌病检测的荧光定量PCR方法,合成目前报道最多的布鲁氏菌IS711插入序列、per基因和bcsp31基因的引物和探针,并分别对这3种荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性以及63份临床样品检测效果进行比较。结果显示：3种荧光定量PCR方法均具有较好的敏感性且均不与其他常见细菌发生交叉反应;3种方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。在检测临床样品时,3种方法的敏感性均高于套式PCR方法,其中IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法符合率为95.24%,其他2种方法与套式PCR方法的符合率为98.41%。比较而言,IS711荧光定量PCR敏感性最高,更适合于布鲁氏菌核酸含量低的样品的检测。     

IBV肾型毒株与呼吸型疫苗株鉴别方法的建立与应用

[目的]建立基于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的反转录-复合PCR方法,为IBV流行毒株和呼吸型疫苗株的分型鉴定提供技术支持.[方法]根据IBV N基因序列设计合成1对特异性通用引物,建立IBV的分子生物学检测方法,用以对IBV进行检测.通过对GenBank上公布的IBV S1基因全序列的分析比对,找出呼吸型疫...     

我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子演化及与疫苗毒株的比较分析

为了解我国大陆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子演化特点,为PRRS防控提供参考,对GenBank中收录的60株PRRSV ORF5基因和NSP2基因进行序列分析.根据ORF5基因和NSP2基因构建的进化树分析表明,我国毒株主要分为4大亚群,其中亚群1为主要分支,以2006年分离的JXA1株为代表的HP-PRRSV毒株,我国HP-PRRSV可能起源于CH1-a和HB-1 (sh)/2002株,其变异是逐渐演变的过程.目前我国流行的毒株中HP-PRRSV占绝对优势,且与高致病性疫苗株(JAX1和HUN4株等)同源性较高.     

耐盐性不同的大豆品种幼苗的蛋白质组学比较研究

为了探讨大豆品种耐盐性的抗性机理,应用蛋白质组学技术,对耐盐大豆品种Lee68和盐敏感大豆品种N2899萌发期幼苗的蛋白质组成进行比较分析。用三氯乙酸/丙酮法提取大豆幼苗的蛋白质,双向电泳技术分离,考马斯亮蓝染色,在pH 4.0～7.0的2-DE胶上平均可检测到约650个的蛋白质点。比较Lee68和N2899幼苗的2-DE图谱,有52个差异表达蛋白点。选取6个蛋白质点,用MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹图谱,搜索大豆UniGene库,成功鉴定出4个蛋白质,分别是GST 9、GST 10、种子成熟蛋白PM36和26 ku未知蛋白;并对这些蛋白质在耐盐性不同品种中可能作用进行讨论。     

3株牛布鲁氏菌19疫苗株赤藓醇代谢基因的克隆与序列分析

对3株(国际标准参考株S19,中国天康疫苗株A19-1,中国中监所标准株A19-2)不同来源布鲁氏菌19疫苗株的赤藓醇代谢基因(Erythritol catabolic gene,简写Ery)进行克隆与序列分析.参照GenBank中布鲁氏菌牛种2308的赤藓醇代谢基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增3株19疫苗株Ery基因,对PCR产物进行克隆、测序分析.与2308比较,S19的Ery基因缺失702碱基,两株中国来源的A19不缺失,但阅读框的51,52位CG变为GC,521,522,523缺失AGG,547位T变为C.引起的氨基酸变化有,13位R变为A,170位T变为A,178位V变为A.赤藓醇代谢基因的克隆测序结果表明,我国的两株A19均不缺失702个碱基,但有3处发生点突变,引起3个氨基酸发生变化.     

基于Label-free技术的不同钾浓度下烟草苗期叶片差异蛋白质组学研究

为了解烟草在不同钾浓度下苗期叶片差异蛋白质的表达情况,分别在高钾和正常钾营养液中培育烤烟品系,应用Label-free蛋白质定量技术分析高钾与正常钾处理苗期叶片的差异蛋白质,对分离鉴定的差异蛋白质进行系统的生物信息学分析,探讨不同钾浓度下差异蛋白质的分布、功能及其作用机制。结果表明,与正常钾处理相比,高钾处理烟草苗期叶片中共有41个差异蛋白质,20个发生下调表达,21个发生上调表达;高钾处理中烤烟苗期叶片差异蛋白质主要定位在细胞组分和有膜细胞器中,大部分差异蛋白质为碳水化合物代谢相关功能蛋白质,且主要参与物质代谢相关途径。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用

为鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株,根据类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株非结构蛋白2(Nsp2)基因序列差异,设计特异性引物和探针,建立TaqMan荧光定量PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.结果显示,2种方法中,标准品在103～...     

放回简单随机抽样下加法模型两种不同情况的比较

本文基于定量特征敏感性随机化模型中的加法模型,探讨了放回简单随机抽样方法下剔除重复单元和全样本两种情况下总体均值的估计问题.     

不同核桃种内杂交坐果率和结实率的差异比较

为创新山东核桃育种材料,本研究在前期核桃种质资源调查的基础上,以青林后代优株和元林为母本、丰硕后代和香玲后代优株为父本开展核桃杂交育种试验,记录不同杂交组合的授粉数、坐果数、结实数,并计算杂交果实坐果率和结实率,同时进行差异比较分析。结果表明:不同核桃种内杂交育种的坐果率、结实率差异显著(P<0.05),其中以母本为青林后代优株的杂交组合中,青林后代优株×丰硕后代优株FSY1杂交组合坐果率和结实率最高;母本为元林的杂交组合中,元林×香玲后代优株的坐果率和结实率最高;母本为青林的杂交组合坐果率和结实率明显高于母本为元林的组合。     

全株玉米青贮饲喂小尾寒羊和不同组合杂交羊生产性能的比较

【目的】在国家大力推进"粮改饲"的背景下,研究以全株玉米青贮为基础的全混合日粮(total mixed ration,TMR)饲喂小尾寒羊和不同组合杂交羊,对其生长性能、屠宰性能和经济效益的影响,为推进全株玉米青贮应用和肉羊健康养殖提供理论支持。【方法】以尼龙袋法对全株玉米青贮前后的营养成分和瘤胃降解性进行评价;饲养试验中选择4个不同品种的3月龄断奶健康公羔羊各30只,体重相近(27.6±1.7)kg,以品种差异分为4个处理,分别是小尾寒羊(SH),"杜泊×小尾寒羊"杂交F1(DH),"蒙古羊×小尾寒羊"杂交F1(MH)和"杜泊×洼地绵羊"杂交F1(DW),每处理3个重复,每重复10只羊,饲喂以全株玉米青贮为基础的TMR,精粗比25:75。预试期10 d,正试期80 d,进行生长性能和屠宰性能的测定。【结果】与青贮前相比,青贮后粗蛋白质含量无显著差异(P0.05),DM含量、有机物(OM)含量和瘤胃降解参数的快速降解部分(a值)显著提高(P0.01),NDF含量、ADF含量和有效降解率显著降低(P0.001)。生产性能方面,不同组合杂交羊比小尾寒羊DMI有增加的趋势(0.05P0.1);杜寒和杜洼杂交羊ADG、FCR、胴体重、净肉重、屠宰率、净肉率和胴体净肉率显著高于小尾寒羊(P0.05)。经济效益方面,各处理的饲料成本无显著差异(P0.05),杜寒和杜洼杂交羊净肉增重、产肉效益和生产利润显著高于小尾寒羊和蒙寒杂交羊(P0.01)。【结论】全株玉米青贮适宜作为肉羊育肥TMR主要饲料来源,不同品种的肉羊均表现出良好的生产性能。其中,杜寒和杜洼杂交羊的生产性能和经济效益均优于小尾寒羊和蒙寒杂交羊,而小尾寒羊和蒙寒杂交羊生产性能无显著差异。由此,杜寒和杜洼杂交羊更适合作为黄淮海农区肉羊育肥品种。