月季CBF 转录因子基因的克隆及表达分析

 根据CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计1 对简并引物,采用PCR 方法对月季‘寒锦4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆;再根据中间片段区域设计了两对特异引物,采用反向PCR 方法对该基因的5'和3'端的序列进行克隆,将中间片段与反向PCR 产物拼接得到CBF 基因全长序列,命名为RhCBF,GenBank 注册编号为EF582843;该基因序列长758 bp,ORF 为603 bp,编码200 个氨基酸;同时,根据基因序列设计1 对特异引物,利用荧光定量PCR分析月季CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导RhCBF 的表达,而干旱处理不能诱导其表达。     

橄榄WRKY转录因子的克隆及其在低温胁迫下的表达分析

【目的】探讨橄榄WRKY转录因子的序列特征及其在生长发育与低温胁迫过程中的调控作用。【方法】以'福榄1号'橄榄为材料,采用RT-PCR技术克隆了4个WRKY转录因子家族成员(分别命名为CaWRKY21、CaWRKY33、CaWRKY50和CaWRKY55),并对其进行生物信息学和qRT-PCR表达模式分析,同时研究橄榄低温胁迫过程中总抗氧化能力的变化。【结果】CaWRKY21、33、50、55开放阅读框分别为561、1 644、357和1 044 bp,预测可分别编码186、547、118和347个氨基酸,GenBank登录号为MG356652、MG356653、MG356654和MG356655。生物信息学分析表明,CaWRKY21、33、50、55的密码子偏好性普遍较弱,均编码不稳定疏水性蛋白质,其中CaWRKY21和CaWRKY55属于第Ⅱ类植物WRKY转录因子,定位于细胞核内,CaWRKY33和CaWRKY50分别属于第Ⅰ类和第Ⅲ类WRKY转录因子,可能分别定位在内质网膜和细胞质中;聚类分析发现,橄榄与番木瓜、甜橙、桉树WRKY的亲缘关系较近。低温胁迫过程中,随着温度下降,橄榄总抗氧化能力和CaWRKY21、33、50、55表达水平均明显上升,在-3℃处理组中达到最高点;此外,它们均呈现器官特异性表达。【结论】WRKY转录因子可能参与橄榄器官形态建成,并且受低温胁迫显著诱导。     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄(Solanumlycopersicum)‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示:SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框,编码498个氨基酸,理论分子量为55.5 kD,含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于Ⅱb类WRKY转录因子基因,且定位于细胞膜上;栽培番茄Sl WRKY16与潘那利番茄Sp WRKY6(XP₀15064265.1)、马铃薯St WRKY6(XP₀06350473.1)同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达,叶片中的表达量最高;短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外,重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上,番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

芹菜AgERF4转录因子基因的克隆与表达分析

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物中高度保守。AgERF4属于亲水性蛋白。酵母单杂交和β–半乳糖苷酶活性测定结果确定AgERF4转录因子和乙烯应答元件GCC Box具有较高的结合活性。RT-qPCR分析表明,AgERF4在芹菜叶片中的表达水平较高,在根和叶柄中表达水平较低;高温和干旱条件下AgERF4的表达呈先上升后下降的趋势,在盐处理的24 h内AgERF4的表达始终高于对照。AgERF4转录因子在芹菜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。     

苹果BR信号转录因子基因MdBZR1的克隆及表达分析

从矮化苹果砧木Malling 9（M9）中分离1个BR信号转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT 1（BZR1）基因,命名为MdBZR1,其开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,有5个保守结构域：核定位信号结构域NLS（MARRKPSWRERENNRRTERRR）、氮（N）端结构域（NLPKHCDNNEVLKALCLQ AGWTVEDDGT）、BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2（BIN2）磷酸化结构域（STKISPYSSLNPSPIPS YOVSPSSSSYPSPTR）、PEST结构域（PTAATIPECDESDASTVDSGQ）和碳（C）端保守结构域（VKPWIGEK IHEVGLDDLELTLGNGKA）。系统进化树分析显示,MdBZR1与美国National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中注释的苹果BZR1基因亲缘关系最近。MdBZR1在M9不同组织均有表达,在顶梢中的表达水平最高;外源BR和生长素处理促进苹果幼苗（M9和平邑甜茶）株高增长,MdBZR1表达量增加;GA处理虽也促进株高增长,但对MdBZR1的表达影响不显著。此外,半矮化砧穗组合长富2号/MM106和乔化砧穗组合长富2号/长富2号接穗中MdBZR1的表达量明显高于矮化砧穗组合长富2号/M9。因此,MdBZR1很可能对苹果树株高具有重要调控作用。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3,将其命名为CsCBF3,GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp,
编码204 个氨基酸。进化树分析表明,CsCBF3 隶属于CBF 基因家族,与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近,
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域,N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区,且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达,且
其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明CsCBF3 是一个快速响应基因,推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

番荔枝开花调控转录因子基因AsLEAFY的克隆与表达分析

利用同源克隆和RACE-PCR获得番荔枝LEAFY基因的全长cDNA序列,命名为AsLEAFY,Gen Bank登录号为KP866145。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsLEAFY基因长为1 236 bp,编码411个氨基酸,该氨基酸序列含有5′-N端脯氨酸富集区和中央酸性区,具有LEAFY(FLO)家族的典型结构特征。同源分析表明,该氨基酸序列与多种木本植物LEAFY类蛋白的同源性较高。进化树分析表明AsLEAFY与木本植物的亲缘关系高于草本植物。实时定量PCR结果表明,AsLEAFY在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,在初期的花芽中表达量最高,在不同组织器官中表达量存在差异,在枝条去叶后的腋芽中的表达量最高。推测该基因在番荔枝花器官形成初期发挥重要作用。     

板栗CmMYB转录因子基因的克隆及在花序发育中的表达分析

板栗大量雄花序影响产量形成,寡雄性状是板栗重要的育种目标。利用RT-PCR与RACE扩增方法,从板栗极短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中分离出一个板栗MYB转录因子cDNA全长,进行测序和序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段总长为1 522 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1 071 bp,可编码长度为357个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与苹果的MYB91、豌豆的MYB转录因子和蒺藜苜蓿的MYB转录因子基因分别具有88%、87%和87%的氨基酸序列同源性。序列分析及空间结构预测发现该序列具有完整的R2R3区域,推测其具有转录激活功能。命名为CmMYB(GenBank登录号为GU076490)。实时荧光定量PCR结果显示,芽变雄花序CmMYB转录因子在雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、雄蕊原基形成期和花药形成期的表达量均低于正常雄花序中的表达量,而在花被原基形成期表达量高于正常雄花序中表达量,说明该转录因子调控的主要基因与雄花序的短化存在一定联系。     

甜瓜CmGnT基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为了探究非生物胁迫下甜瓜N–乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的作用机制,根据甜瓜cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到CmGnT。生物信息学分析表明,CmGnT的cDNA全长为2 193 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸。CmGnT蛋白分子量约为46 kD,理论等电点(pI)为7.93。蛋白结构分析表明,CmGnT含有β–1,4–N–乙酰氨基葡萄糖转移酶结构域,属于糖基转移酶17家族。该基因编码的蛋白有1个强的跨膜螺旋结构。进化树分析表明,CmGnT氨基酸序列与黄瓜CsGnT(登录号:XP_004135275.1)亲缘关系最近,同源性为99.74%,与西瓜Cs Gn T的同源性为97.70%。实时荧光定量PCR分析结果表明,在NaCl、PEG、H_2O_2和ABA等非生物胁迫下的甜瓜叶片中CmGnT都显著上调表达,表明CmGnT受非生物胁迫诱导,推测其在甜瓜响09应非生物胁迫过程中起到重要作用。     

盐碱胁迫下羊草转录因子的转录组分析

以羊草为试材,采用罗氏454二代测序方法,研究了羊草转录因子家族在逆境胁迫条件下来自38个家族的243个转录因子表达差异模式,以期揭示WRKY、C3HL、NAC等转录因子家族差异基因数量,探讨羊草的抗逆分子机制。结果表明:羊草转录组测序片段经de novo拼接共获得104 105条Unigene序列,对照含有97个转录因子基因,盐碱处理组含有213个转录因子,其中67个转录因子为2组共表达。差异基因表达分析揭示羊草主要通过WRKY、C3HL、NAC转录因子家族的差异表达调控盐碱适应性。该研究为耐盐碱型作物培育奠定了基础。     

西瓜bHLH转录因子家族基因的鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

利用生物信息学方法,在西瓜测序基因组97103中共鉴定出96个bHLH家族成员,其中有94个可以被定位到西瓜的11条染色体上。通过基因结构和结构域序列保守性的预测,发现这些基因的序列长度和内含子数量变化很大,但bHLH结构域序列比较保守。用拟南芥中39条已知的bHLH蛋白序列和西瓜的96条bHLH蛋白序列构建系统发育树,结果显示西瓜的bHLH家族可以进一步被分为11个亚族。运用荧光定量实时PCR技术,分析了该家族中21个基因在西瓜响应非生物胁迫时的表达水平,结果表明,8个基因受低温胁迫诱导表达,13个基因受ABA胁迫诱导表达,14个基因受盐胁迫诱导表达。ClabHLH41在3种胁迫下表达量均显著增加,说明其在低温、ABA和盐胁迫应答中可能发挥着重要作用。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

辣椒乙烯反应转录因子基因CaJERF1 的克隆及诱导表达

 应用RT-PCR、RACE技术从乙烯诱导的辣椒中克隆到一个乙烯反应（ERF）类转录因子基因,命名为CaJERF1,其全长cDNA序列为1 379 bp,编码375个氨基酸,分子量为41.5 kD,具有一个由59个氨基酸构成的保守的ERF结构域。CaJERF1的AP2域与CaPF的同源性为100%,与JERF1的同源性为99%;全序列与CaPF和JERF1的同源性也分别达到99%和86%,属于ERF家族的第Ⅳ次家族。诱导分析表达结果表明,植物激素乙烯、苿莉酸甲酯以及盐和低温胁迫均可诱导该基因的表达,表明CaJERF1可能参与到多条信号途径中,并在多种逆境胁迫应答中发挥作用。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYBIO基因的克隆、序列分析及原核表达

目的：克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f．neiclzwet-zkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。     

沟叶结缕草对践踏胁迫的生理响应

以沟叶结缕草(Zoysia matrella)为试材,研究了践踏胁迫下抗氧化酶活性、渗透调节物质含量和光合参数的变化,以期从生理学角度认识沟叶结缕草耐践踏特性。结果表明:践踏胁迫使沟叶结缕草光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)呈降低趋势,在中度和重度践踏下,沟叶结缕草气孔导度(Gs)比对照显著增加(P0.05)。践踏胁迫对沟叶结缕草叶片抗氧化酶活性的影响不尽相同。践踏胁迫下,沟叶结缕草叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先下降后升高趋势,而过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性呈先升高后降低趋势。沟叶结缕草可以通过增加体内游离脯氨酸和可溶性糖的含量,有效改变细胞的渗透势,从而改变自身的渗透调节能力以抵抗践踏导致的渗透胁迫。     

杜梨2个MYB转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)MYB家族的2个基因(Pb3RMYB和Pb4RMYB),分析其序列特征,为研究其调控的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆杜梨Pb3RMYB和Pb4RMYB的c DNA序列全长;利用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、TMHMM、Signal P、Plant-m Ploc、SPOMA、DANMAN、MEGA6等软件对氨基酸序列进行分析。【结果】克隆得到Pb3RMYB和Pb4RMYB基因全长,Gen Bank登录号分别为KX272614和KX272615。2者均含有MYB保守结构域,二级结构均以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-折叠为主,亚细胞定位分析表明2者均定位于细胞核中。其中,Pb3RMYB属于3R-MYB亚家族,全长2 355 bp,ORF长1 710bp,编码569个氨基酸,蛋白分子质量约为62 077.3 Da,等电点为7.08;BLAST分析表明Pb3RMYB与已报道的其他物种3RMYB具有较高的相似度。Pb4RMYB属于4R-MYB亚家族,全长3 625 bp,ORF长2 913 bp,编码970个氨基酸,蛋白分子质量约为109 600.6 Da,等电点为7.41。【结论】获得了2个杜梨MYB基因Pb3RMYB和Pb4RMYB,分别属于3RMYB和4R-MYB亚家族。     

苹果中乙烯响应转录因子基因的克隆及序列分析

乙烯响应因子(AP2/ERF)转录因子家族是植物中广泛存在的一类转录因子,它们对植物的生长发育、次生代谢过程和植物的抗胁迫能力具有重要的调控作用。通过对苹果中响应乙烯的转录因子(ERF)家族进行分析,选择具有代表性的转录因子基因进行设计引物。以苹果果皮为试验材料,从中分离出响应乙烯的转录因子1、2、3、5的基因,并对其进行序列比对分析,发现这4个基因序列差别较大,但具有很保守的共同序列,初步确定其功能上有一定的相关性。