转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米植株的获得及其后代分析

本研究使用In-Fusion TM试剂盒构建植物表达载体p TF101.1-P35S::Cry1Ab-Ma,以玉米杂交种HiⅡ幼胚为受体材料,采用农杆菌介导法将P35S驱动的抗虫基因Cry1Ab-Ma基因转入玉米,经双丙氨膦筛选后的抗性愈伤分化出43株玉米幼苗,经目的基因PCR及表达蛋白检测,其中的28株呈阳性。T1代植株叶片蛋白粗提物经Cry1Ab免疫试纸条检测,结果表明目的基因表现出分离,在部分转基因植株后代中获得了表达。本研究为培育优良的抗虫玉米自交系奠定了基础。     

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。     

转Cry2A基因抗虫甘蔗植株的培育

Bt基因具有广谱杀虫性,培育转基因抗虫品种为甘蔗病虫害防治提供了新思路。为了检验Cry2A基因对甘蔗螟虫的防治效果,本研究构建了由玉米Ubi启动子驱动的Cry2A基因高效植物表达载体Cry2A-3300,利用农杆菌介导技术,对甘蔗胚性愈伤组织材料进行遗传转化,经过筛选培养及再生培养共得到46株抗性植株。对抗性植株进行PCR扩增检测,15株呈阳性;进一步利用RT-PCR,表明外源基因Cry2A在转录水平上得到有效表达。室内抗虫鉴定的结果表明Cry2A基因可有效抑制害虫的生长,这将有利于后期进行田间防治。     

转Bt cry1Ah/2mG2-epsps双价基因抗虫/耐除草剂玉米研究

构建了含有Bt杀虫基因cry1Ah和耐草甘膦基因2mG2-epsps的双价植物表达载体pMAGUHM,通过基因枪轰击Q31×Z31杂交组合的胚性愈伤组织,以2mG2-epsps为筛选标记,通过1mmol/L草甘膦异丙胺盐筛选,获得T0代转化植株80株,其中PCR检测有36株为阳性植株,阳性率达45%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,证明外源基因已整合到玉米基因组中并正确表达。草甘膦及玉米螟抗性检测结果表明,有5个转基因品系表现出具有耐草甘膦和抗虫的双重特性。     

抗玉米螟基因Cry1A.301原核表达和玉米遗传转化

增强玉米品种的抗虫性是减少玉米螟为害、提高玉米产量的有效途径。通过密码子优化改造获得抗虫基因Cry1A.301,构建原核表达载体pET30a-Cry1A.301,进行蛋白免疫学、ELISA检测以及玉米螟抗性生测。结果表明,原核表达载体中Cry1A.301蛋白高效表达,且7d后杀虫效率达100%。通过Cry1A.301基因与植物表达载体CPB连接,构建CPB-35S∶∶Cry1A.301-35S∶∶bar载体进行农杆菌介导的玉米萌动胚遗传转化,得到12株T0代转基因植株。T0代植株叶片中目的基因、筛选标记bar基因的PCR检测与蛋白免疫学检测结果表明,Cry1A.301基因已经整合到玉米基因组并表达。     

CryIA(a)-pta双价抗虫基因转化粳稻及二化螟抗性评估

向作物中转多价抗虫基因是增强作物抗虫性、拓宽抗虫谱、延长抗虫时限的有效措施。从粳稻品种吉粳81、吉粳88和通887的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,利用农杆菌介导法,转化苏云金杆菌毒蛋白基因CryIA(a)和半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)基因。表达双价抗虫基因的载体p3300-bt-pta的bt和pta分别由Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子驱动,宿主菌株为EHA105。用除草剂草丁膦(PPT)筛选得到转基因植株25株。以bt基因和pta基因两端序列为引物在一个反应体系同时做2个基因的PCR检测,检测到bt、pta基因的2条带,Bar基因的PCR检测也显阳性。转化株对PPT除草剂抗性鉴定呈抗性,证明外源基因已整合到水稻基因组中。水稻二化螟接虫鉴定结果表明,23株转基因植株抗虫性比对照明显提高,2株表现感虫。     

转Cry1Ab-t基因玉米YA108的获得及其抗虫性鉴定

为了培育优良的抗虫玉米自交系,通过农杆菌介导的方法,将含有自主改造合成的抗虫基因Cry1Ab-t的植物表达载体pCAMBIA3300m导入玉米杂交种HiII基因组中,通过双丙氨磷筛选、PCR检测获得阳性转基因植株,采用RT-PCR、试纸条、ELISA方法检测外源基因的表达情况,并进行抗虫性鉴定。结果表明,用双丙氨磷筛选后,获得了116株转基因玉米植株;经目的基因Cry1Ab-t和标记基因Bar的PCR检测,获得转基因阳性植株82株。选取长势好的转基因材料YA108进行RT-PCR、Bt-Cry1Ab/Ac试纸条和ELISA分析发现,转基因玉米YA108的Cry1Ab-t基因在转录、翻译水平上均表达。玉米花丝接虫试验表明,非转基因玉米花丝虫食严重,表现为高感玉米螟;而转基因玉米YA108花丝抗虫效果明显,均达到高抗水平,抗虫性表现稳定;吐丝期接虫试验表明,非转基因玉米接虫后期被咬食严重,茎秆多处有蛀孔,伤口处大多有霉菌,而转基因玉米YA108没有受到危害。田间接虫后,无论叶片和花丝,转Cry1Ab-t基因抗虫玉米材料YA108对亚洲玉米螟都具有非常好的抗性,能够短时间杀灭玉米螟幼虫,并极大程度减少了由于虫害引起的霉变。室内和田间接虫鉴定结果表明,转基因玉米YA108对亚洲玉米螟有较强的杀虫效果,田间抗虫等级为1级,抗性水平为高抗。     

基因枪法转Bt/GNA基因超甜玉米植株的获得及抗虫性鉴定

以超甜玉米自交系S1幼胚诱导的愈伤组织为受体材料,利用基因枪法共转化Bt和GNA基因,获得了128株再生植株,移栽成活31株,其中26株可育.经PCR检测外源基因整合进玉米基因组中,含Bt基因11株,其中有5株能扩增出GNA基因.Southern杂交证明,目的基因已经整合在玉米基因组中.对9株转基因T1代植株叶片室内接虫抗性鉴定,结果显示,5株转基因植株叶片饲喂6 d后明显抑制玉米螟幼虫的发育,幼虫体重增加较少,幼虫死亡率高,表现较强的抗性.     

农杆菌介导抗除草剂基因bar和抗虫基因cry1ab/ac转化甘蓝型油菜的研究

为了获得同时具备抗虫和抗除草剂特性的甘蓝型油菜新种质材料,以湘油15下胚轴为外植体,将人工合成的抗虫融合基因cry1ab/ac与带有草铵膦抗性基因bar的植物表达载体pFGC5941连接,构建了植物表达载体pFGC-Bt。利用农杆菌介导油菜下胚轴遗传转化体系,将载体pFGC-Bt转入到油菜品种湘油15愈伤组织中。经愈伤组织分化和植株再生,获得了7株T0转基因植株。分株收获这7株转基因油菜的种子,种于花盆中,用除草剂basta喷洒,对存活下来的植株用检测引物进行PCR检测。挑选11株2个基因检测结果都呈现阳性的植株,进行Cry1Ab/Ac蛋白双抗体夹心免疫层析技术检测,在这11株油菜中都检测到了Cry1Ab/Ac蛋白。进行转基因油菜抗菜粉蝶幼虫(菜青虫)的离体鉴定,以非转基因湘油15为对照,结果显示,啃食了转基因油菜叶片的菜青虫停止运动和生长,大概7 d后陆续死亡,而非转基因油菜叶片上的菜青虫表现正常,3 d后叶片基本被其啃食干净。饲喂鉴定结果表明,转抗虫融合基因cry1ab/ac油菜对菜青虫具有明显抗性。得到了同时具有菜青虫和草铵膦双抗性的转基因植株,且抗性显著,为油菜的抗性育种提供了新的材料。     

转抗虫基因Cry1Iem大豆的分子鉴定与功能验证

通过转抗虫基因来提高作物的抗虫性是一条有效途径,以此来提高作物的产量和品质。本研究以转抗虫基因Cry1Iem大豆的T2、T3株系作为试验材料,利用常规PCR检测、Southern杂交、荧光定量PCR技术对转抗虫基因Cry1Iem株系进行分子鉴定;同时对40个转基因阳性株系进行室内人工接虫、200个转基因阳性株系室外网室接虫并进行抗虫性鉴定。选取其中10个株系进行常规PCR检测,结果在T2、T3当中都检测到了Cry1Iem、Bar、启动子CaMV35S、Nos目标片段,表明目的基因已被顺利导入受体JN28大豆植株当中并得到了稳定遗传;选取其中5个T2、T3转基因株系进行Southern杂交,结果显示:目的基因以单拷贝的形式整合到了大豆基因组当中;荧光定量PCR检测结果表明,Cry1Iem基因在选取的3个转基因株系中均得到了表达,而在非转化的受体JN28当中未检测到荧光信号。室内抗虫性鉴定结果显示40个转Cry1Iem基因株系豆荚内活虫的成活数量明显低于受体材料JN28大豆豆荚内的活虫数量,表明转基因材料具有显著的抗虫性。室外抗虫性鉴定结果表明:JN28大豆受体植株的虫食率为6.72%,属于感虫品种;而200个转Cry1Iem基因株系的平均虫食率为3.81%,属于抗虫品系。本研究结果为中国转基因抗虫大豆新品种的选育提供部分参考数据。     

转cry1C~*基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性研究

为了研究转基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性,将10个来自于不同独立抗性愈伤组织的转cry1C*基因抗虫超级粳稻品系种植于田间,利用实时荧光定量PCR方法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官目的基因mRNA,利用酶联免疫吸附(ELISA)法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗及收获后糙米的Cry1C蛋白,利用田间目测调查二化螟危害的白穗率。结果显示,转基因超级粳稻不同品系及不同器官cry1C*基因田间表达量明显不同,cry1C*基因mRNA表达量:叶片茎鞘幼穗,蛋白质表达量:叶片茎鞘幼穗糙米。转基因超级粳稻田间目的基因表达,在mRNA水平和蛋白质水平,不同器官间存在正相关关系,各器官Cry1C蛋白质含量和糙米Bt蛋白质含量呈正相关。在本研究范围内,不论转基因粳稻植株Cry1C蛋白质含量高或低的品系,田间均表现为高抗二化螟。培育转基因抗虫粳稻品种时,应注意对目的基因适量表达的抗虫基因型的选择。     

通过基因枪和农杆菌介导用BADH基因转化小麦

土壤盐碱是一种严重障碍作物生产的环境因子,甜菜碱醛脱氢酶BADH基因是一种重要的可赋予植物渗透调节抗性的基因。本研究用基因枪法及农杆菌介导法向小麦幼胚和成熟胚愈伤组织导入了BADH基因。用PDS-1000／HE基因枪轰击2933块幼胚愈伤组织,分化出了45株再生植株,分化率为1．53％。PCR分析表明,其中的5株为BADH基因转化植株。用PPT涂抹其叶片,进一步证实了PCR的结果。以小麦成熟胚愈伤组织为受体,用农杆菌介导转化1968块愈伤,仅再生出了5株绿苗,PCR检测结果均为阴性。但对其转化愈伤组织的PCR检测表明,外源基因已在受体细胞中实现了整合。以幼胚愈伤组织为受体,用农杆菌介导转化2933块愈伤,共再生出了21株绿苗。对其进行PCR检测,仅有5株为BADH基因转化植株。转化处理过的幼胚愈伤组织的绿苗再生率（0．72％）高于成熟胚愈伤（0．25％）。与对照相比,所有的转化植株均能够在0．5％NaCl（w／w）条件下正常生长,表明外源BADH基因已经整合并表达。     

转Cry1A基因海岛棉的获得和鉴定

进行农杆菌介导转抗虫基因试验，以期选育抗虫性优良的海岛棉新品系(品种)；本实验在海岛棉体细胞胚再生体系的基础上，将携带Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到‘新海33号’的胚性愈伤组织中。经培养基筛选、PCR检测、RT-PCR检测、抗虫性鉴定等筛选抗虫后代。经培养基筛选共获得12棵抗性植株。PCR检测结果显示，这12棵抗性植株均能扩增出了大小相符的片段，检测结果呈阳性；RT-PCR结果显示，12棵转基因植株目的基因已经整合入基因组，且能反转录出mRNA；Bt-Cry1Ab/Ac转基因试纸条检测结果表明这12棵转基因植株含有目的蛋白；抗虫性鉴定结果证实了这些转基因植株对棉铃虫幼虫具有一定的抗性。本研究成功将抗虫基因导入至海岛棉的体内，获得了具有抗虫性的植株，其结果对转基因抗虫海岛棉新品种的培育具有一定的参考价值。     

转cry1C基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性

为了研究转基因抗虫超级粳稻田间目的基因表达及抗螟虫性,将10个来自于不同独立抗性愈伤组织的转cry1C*基因抗虫超级粳稻品系种植于田间,利用实时荧光定量PCR方法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官目的基因mRNA,利用酶联免疫吸附(ELISA)法检测孕穗期叶片、茎鞘和幼穗及收获后糙米的Cry1C蛋白,利用田间目测调查二化螟危害的白穗率。结果及分析显示,转基因超级粳稻不同品系及不同器官cry1C*基因田间表达量明显不同,cry1C*基因mRNA表达量叶片＞茎鞘＞幼穗,蛋白质表达量叶片＞茎鞘＞幼穗＞糙米。转基因超级粳稻田间目的基因表达,在mRNA水平和蛋白质水平,不同器官间存在正相关关系,各器官Cry1C蛋白质含量和糙米Bt蛋白质含量呈正相关。在本研究范围内,不论转基因粳稻植株Cry1C蛋白质含量高或低的品系,田间均表现为高抗二化螟。培育转基因抗虫粳稻品种时,注意对目的基因适量表达的抗虫基因型的选择。     

玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明,该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明,在小麦幼胚愈伤组织中,玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低,但经纹枯病菌诱导后,ZmPR4启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性,能够驱动GUS基因的表达。因此,玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究

本研究以优良玉米自交系X2211和78599的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用基因枪介导法将抗除草剂基因2mG2-epsps导入玉米胚性愈伤组织,经草甘膦(glyphosate)筛选,产生抗性愈伤组织并获得320株再生植株,通过喷施除草剂筛选,有65株表现良好的耐除草剂特性。PCR分析表明,其中的7株表现PCR阳性,初步证明2mG2-epsps基因整合到玉米基因组中,平均转化率为2.2%。同时研究了金粉用量和轰击距离对玉米基因枪转化效率的影响。转化时以金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm最佳。     

农杆菌介导法获得桃叶卫矛转Bt基因植株

虫害一直是制约农林作物高产、优产和稳产的重要因素,开展植物抗虫性研究具有关键的理论和实践意义。本研究使用农杆菌介导法,以桃叶卫矛(Euonymus bungeanus Maxim.)的愈伤组织为外植体材料,研究农杆菌的菌液浓度、侵染时间及共培养时间对桃叶卫矛叶片愈伤组织转化效率所产生的影响;并在建立的最佳转化体系下将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) Bt基因及豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea trypsin inhibitor) SCK基因导入桃叶卫矛中,最终获得稳定表达的转化植株。结果显示,在侵染菌液OD_(600)=0.5～0.6,侵染时间30 min,共培养5 d的条件下,桃叶卫矛叶片愈伤组织的转化效率最好,经PCR鉴定检测后,在23株抗性植株中有10株同时检测到两个抗虫基因的表达,证明外源抗虫基因已导入桃叶卫矛基因组中。本研究将为卫矛科植物的抗虫性育种工作提供一定的理论基础。     

农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究

将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织。探讨了不同菌浓度、不同侵染时间和不同的共培养时间对玉米转化率的影响,确定了最佳转化条件:菌液浓度OD600值为0.5～0.7,侵染时间为25min,共体培养时间为3d。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,获得了2株阳性植株,初步证明外源基因已经整合到玉米的基因组中。     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。