奶牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

本试验旨在制备高纯度和特异性的奶牛αs-酪蛋白多克隆抗体,为鉴定奶牛乳腺合成的αs-酪蛋白提供试验材料。选用4只健康新西兰大白兔,每2周免疫1次奶牛αs-酪蛋白,待血清达到抗体效价后,对兔进行颈动脉放血并分离血清,利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。结果表明,经过饱和硫酸铵法和蛋白A树脂2步纯化后得到了纯度较高的抗体,同时可以特异性结合奶牛αs-酪蛋白。本试验制得的抗体可以用于鉴定奶牛乳腺合成的αs-酪蛋白,为进一步研究奶牛αs-酪蛋白合成的调控提供了有效的科研材料。     

α-酪蛋白和κ-酪蛋白基因型对Murciano-Granadina山羊乳成分的影响

研究结果表明,羊的α-酪蛋白的基因多态性影响乳的品质;但是κ-酪蛋白的基因型是否影响乳的组成还知之甚少。并且α-酪蛋白和K-酪蛋白基因型的交互作用也研究较少。因此,本试验选择89头Murciano-Granadina山羊旨在研究α-酪蛋白和κ-酪蛋白基因型与乳品质之间的关系。在Murciano-Granadina山羊316 d的泌乳期内,每隔一周测定一次乳产量、总蛋白、乳脂肪、非脂固形物、乳糖、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白等的含量。结果表明,αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白基因型之间没有交互作用。与κ-酪蛋白的AA基因型相比,κ-酪蛋白的AB和BB基因型显著影响乳中总蛋白和蛋白质分数。并且试验结果与法国在山羊品种上的试验结果不同,本试验结果证明,αs1基因型不影响乳蛋白、酪蛋白和脂肪的含量。生产上当考虑山羊乳的成分时,应对κ-酪蛋白基因型引起足够的重视。     

牛乳中α-酪蛋白完全抗原的合成及多克隆抗体的制备

In order to gain polyclonal antibody against α-casein, the commercial α-casein were linked with carrier protein BSA and OVA, respectively, as immunogen (α-casein-BSA) and coating antigen (α-casein-OVA). The reaction products were identified by nondenaturing PAGE and SDS-PAGE. New Zealand White rabbits were immunized with the immunogen (α-casein- BSA) to produce polyclonal antibody. The results showed that the titer of the antibody was 1∶256000 and had high cross reactivity with κ-casein. It could be used to detect the total amount of α-casein and κ-casein in milk.     

两种纯化羊驼BVDV抗体血清的方法

为了纯化2种用于不同用途的羊驼牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体血清,笔者分别使用(A|")KTAavant纯化柱直接纯化和抗原偶联亲和层析纯化特异性BVDV抗体,用ELISA测定抗体效价,SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot分析抗体的特异性。结果表明,2种方法纯化的抗体特异性均较好,可根据后续具体试验选择纯化方法。     

αs1-酪蛋白的IgG抗原决定簇的识别

以αs1-酪蛋白氨基酸序列为模板,错位合成αs1-酪蛋白多肽,以收集到的牛奶过敏患者血清为抗体,鉴定αs1-酪蛋白IgG抗原决定簇,探讨牛奶过敏机理。结果表明,αs1-酪蛋白IgG抗原决定簇有3条,其氨基酸序列定位为aa36-50,aa71-85,aa176-190。本研究为特异性水解抗原决定簇实现牛奶脱敏的方法提供了理论依据。     

α-乳白蛋白与β-酪蛋白预防炎症的协同作用研究

牛乳中酪蛋白比例高,而母乳中乳清蛋白含量高,α-乳白蛋白、β-酪蛋白作为母乳中主要的乳清蛋白和酪蛋白,以α-乳白蛋白和β-酪蛋白为研究对象,利用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞炎症反应,探究不同比例的组合蛋白对细胞炎症的预防作用,探索乳清蛋白和酪蛋白的最佳配比,使婴配粉更贴合母乳。结果表明,添加α-乳白蛋白和β-酪蛋白单体能改变炎症因子mRNA和蛋白水平的表达,然而当混合比例为1:0.17时效果最佳,能显著降低白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、髓样分化基因88(MyD88)、Toll样受体4(TLR4)在mRNA水平的表达,在蛋白水平降低IL-6 1.99倍、白介素1β(IL-1β)3.91倍、肿瘤坏死因子α(TNF-α)2.72倍。通过抑制非TLR4介导炎症信号通路关键蛋白NF-κB p65的磷酸化抑制炎症的发生。本研究明确了α-乳白蛋白和β-酪蛋白预防炎症发生的最佳比例,初步阐明了两者协同抗炎的作用机理,为其在婴幼儿配方奶粉中的精准添加提供理论支持和技术指导。     

重组牛α-干扰素的原核表达与纯化

为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。     

牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体。经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600。Western-blot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具。     

青海牦牛乳中α_(S1)-酪蛋白的电泳研究

对 2 0 1头青海牦牛乳中αS1 酪蛋白 (αS1 CN)进行了电泳分析。结果发现 :(1 )αS1 CN有αS1 CNBB ,αS1 CNBC ,αS1 CNBE ,αS1 CNCC ,αS1 CNCE和αS1 CNEE 6种基因型 ;(2 )αS1 CN基因座受αS1 CNB,αS1 CNC 和αS1 CNE3个复等位基因控制 ,其基因频率分别为 0 0 896 ,0 631 8和 0 2 786 ;(3)青海牦牛αS1 CN有效等位基因数为 2 0 62 6个 ,基因杂合度为 0 51 5 1 8,基因纯合度指数为 0 393 9;(4)环湖型牦牛与高原型牦牛αS1 CN的多态性特征相似 ,两者之间的遗传距离很小 (3 34× 1 0 - 3) ,基因分化程度低 (0 70 % )。     

牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600.Westernblot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具.     

牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体。经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600。Western-blot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具。     

鸭MHCⅡα基因的表达纯化与抗体制备

根据NCBI上已发表的序列自行设计引物,通过RT-PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到鸭MHCⅡα基因,将其克隆至pMD18-T,经酶切分析及序列测定鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pET-28a.转化大肠杆菌BL21中诱导表达.电洗脱纯化蛋白,用于免疫昆明小鼠制备多克隆抗体.结果表明:克隆了鸭MHCⅡα基因,大小为633 bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为99%;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度可达90%,制备的鼠抗鸭MHCⅡα多克隆抗体经酶联免疫吸附试验(ELISA)与免疫印迹法(Western-blot)证实了抗体的效价高、特异性强,研究结果为研究鸭MHCⅡ分子奠定了基础.     

柴达木绒山羊乳α—酪蛋白的电泳分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳对66只柴达木绒山羊乳样的α－酪蛋白（α-CN)进行了分析。结果表明，α－CN具有3种电泳表型而表现出多态性；α－CNAA，α-CNBB和α-CN AB分别占25．8％，33．3％和40．9％。α-CN^A和α-CN^B等位基因频率分别0．462和0．538。     

奶牛A1/A2-β-酪蛋白等位基因型检测方法研究进展

奶牛A1/A2-β-酪蛋白等位基因型决定了其所产牛奶的类型。A2奶的成分因更接近母乳广受市场欢迎。A1/A2-β-酪蛋白等位基因分型检测在A2基因型奶牛分群饲养、选育及交易等过程中具有重要作用,对A2奶牛养殖具有重要意义。文章就目前已报道的用于鉴别奶牛A1/A2等位基因型的聚合酶链式反应-限制性酶切片段多态性(PCR-RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、TaqMan探针法、rhAmp法和高分辨率熔解曲线分析法(HRM分析法)进行总结,分析各种方法的优劣势及适用性,旨在为奶牛A1/A2等位基因型鉴别方法的选择和新方法的研发提供科学依据和理论参考。     

κ-酪蛋白基因及其功能研究进展

κ-酪蛋白(kappa-casein,-κCN)是牛乳中的一种重要的蛋白质。作者简要介绍了κ-酪蛋白基因的结构、遗传多态性与产奶性状的关系及其编码蛋白质的生物学功能等方面的研究进展。     

奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导

本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好.     

热加工方式对牛乳过敏原αs1-酪蛋白二级结构和抗原性的影响

为探究热加工方式对牛乳过敏原αs1-酪蛋白构象和抗原性的影响,利用间接竞争酶联免疫吸附测定方法、 免疫印迹方法分析不同加热条件下αs1-酪蛋白免疫原性的变化,进而通过8-苯胺-1-萘磺酸荧光探针和圆二色谱分 析其二级结构变化,初步揭示热处理调控过敏原αs1-酪蛋白抗原性的机制。结果表明：在80 ℃、60 min,90 ℃、 10 min,90 ℃、60 min条件下热处理后,αs1-酪蛋白中α-螺旋结构含量显著低于未加热αs1-酪蛋白,在70 ℃、 20 min,80 ℃、20 min,90 ℃、20 min条件下热处理后,αs1-酪蛋白中无规卷曲含量显著增加,70～100 ℃加热 20 min条件下表面荧光强度最强,其他温度-时间条件下二级结构含量变化不显著;αs1-酪蛋白构象的变化导致αs1-酪 蛋白的抗原性显著降低,间接竞争酶联免疫吸附测定显示,在70～100 ℃加热20 min条件下,αs1-酪蛋白的抗原残留 量均较高,而免疫印迹方法显示不同温度-时间条件下αs1-酪蛋白仍具有免疫反应特性,建议进一步通过动物实验揭 示热处理调控αs1-酪蛋白抗原性的机制。     

αs1-酪蛋白基因研究进展

本文就αs1-酪蛋白基因结构和表达调控研究进展作一综述。     

奶牛乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白提取方法的改进及其对细胞分泌功能的影响

通过调节乳腺上皮细胞培养液的温度和pH值,建立了提取β-酪蛋白的物理沉淀法,利用Western blot方法进行鉴定。并将该物理沉淀法与其他3种不同方法进行比较,认为物理沉淀法更加简便、快捷、有效。同时,用物理沉淀法对不同培养天数细胞的分泌能力进行了分析。通过绘制细胞生长曲线和Western blot方法检测,结果显示:组织块贴壁培养法培养至9¹1d时,乳腺上皮细胞的细胞数量最多,分泌活性最强。     

乳制品中A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白含量的测定

本检测方法在已有检测方法资料的基础上,通过改变柱温和梯度洗脱条件,提高A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白的分离效果,以便更好的分析乳制品中A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白的含量。本检测方法使用盐酸胍、二硫苏糖醇使β-酪蛋白变性,流动相选择B(乙腈),A(0.1%三氟乙酸水溶液),流速0.5 mL/min,梯度洗脱,柱温50℃,反相色谱柱进行分离,紫外检测器214 nm检测。采用本方法可以较好地分离牛乳中的A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白,并且出峰时间稳定。A1 β-酪蛋白在0.16～1.65 mg/mL浓度范围内线性关系良好,回归方程y=1.25×10⁶x-1.44×10⁵,R²=0.9985,R=0.9992,回收率范围96.4%～105.0%,精密度小于2.0%;A2β-酪蛋白在0.34～3.35 mg/mL浓度范围内线性关系良好,回归方程y=3.16×10⁶x-3.16×10⁵,R²=0.9988,R=0.9994,三浓度水平加标回收率范围97....