上海株犬冠状病毒的分离鉴定及S基因的遗传进化分析

利用A72细胞(犬纤维肉瘤细胞系)从上海市某宠物医院临床表现为急性胃肠炎症状的幼犬腹泻粪便中分离到1株病毒,通过噬斑纯化、病毒理化特性检测以及动物回归实验和RT-PCR鉴定,证明所分离到的病毒为犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCV),将其命名为CCV-SHdc株。根据Gen Bank公布的CCV S基因序列,设计合成4对特异性引物,利用RT-PCR成功扩增获得CCV-SHdc株S基因序列,同时进行序列测定和核苷酸系统发育进化树绘制。结果显示,CCV-SHdc株的S基因序列全长4 364 bp;该毒株与日本分离的CCV 5821株亲缘关系最近,处于同一分支,与意大利分离的CCV 23/03和CCV Elmo/02株亲缘关系较远。核苷酸与氨基酸同源性分析表明,CCV-SHdc株与CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能属于不同基因型,已有很多点发生突变,这种突变的累积有可能引起病毒毒力的变化。     

犬冠状病毒核酸探针的制备及其基因序列的测定与比较

采用RT—PCR方法扩增犬冠状病毒(CCV)YSl、CI1和NL—18株5’端部分S基因序列，以随机插入DNA法对CCV YSl株纯化的PCR产物标记^32P同位素，制备核酸探针，并与3株CCV反转录产物杂交。用平端连接法将3株CCV PCR产物克隆于pUCl9 SmaI位点或pGEM—T载体中，经PCR鉴定为正确重组质粒。以双脱氧末端终止法测定了重组质粒的cDNA核苷酸序列，并用DNASIS计算机软件进行多重比较分析，绘制系统树。结果表明，所制备的核酸探针可与3株CCV反转录产物杂交，其核苷酸序列与多株CCV相应序列的同源性高达91．9％-99．1％，为CCV的保守区。由此说明，制备的酸破探针可用于犬CCV感染的分于流行病学研究。     

犬冠状病毒YS1株细胞培养弱毒的实验免疫研究

应用纯化后的犬冠状病毒 (CCV)YS1株细胞培养致弱的弱毒 (CCVYS1V60 ) ,经口鼻和肌肉接种CCV ,SN抗体小于 1∶2的易感犬作安全试验 ,结果未见任何CCV临床症状与病理解剖学改变 ;用不同剂量的该CCV弱毒分组免疫CCV易感犬 ,经SN抗体测定与用CCV强毒攻毒试验 ,结果SN抗体达 1∶60以上的犬 90 %以上可获得免疫保护 ;应用该CCV弱毒分别免疫母源抗体达 1∶4和 1∶8的 2组试验犬 ,第 1次免疫 1 4d后SN抗体均未见升高 ,追加 2～ 3次免疫后 ,SN抗体才逐渐上升至 1∶60以上的免疫保护水平 ;用CCV易感犬和猫肾传代细胞 (CRFK)分别将该CCV细胞培养弱毒连续传 5代和 2 0代 ,结果对犬仍然安全 ,免疫原性也未见下降 ;与犬瘟热病毒 (CDV)、犬传染性肝炎病毒 (ICHV)和犬细小病毒(CPV)弱毒作免疫互扰试验 ,结果与各弱毒的单独免疫结果未见差异 ;该毒的免疫期在 1年以上 ,- 2 0℃冻结保存的保存期为 9个月。     

大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析

从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒，经鉴定为犬冠状病毒（命名为CCV DXMV）。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2，以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14，分段扩增了CCVDXMV株部分S基因，得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中，通过筛选和鉴定，获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序，将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列，拼接成全S基因序列，并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较，绘制进化树。结果表明，该株病毒与CCV K378株的同源性最高，达到99．4％；而与CCV 23／03株的同源性最低，为56．9％；与FIPV和TGEV分别有90．4％和82．1％的同源性。     

混合感染病例中犬冠状病毒变异株的分离鉴定

某犬群发生具有呼吸道和消化道症状的传染病,86只幼犬发病,治愈65只,死亡21只.为确诊病原,用MDCK细胞,从死亡犬肠道病料中分离到2株病毒,经理化学鉴定、动物复归试验、电镜检查、PCR检测证明为犬冠状病毒和犬腺病毒2型,定名为CCV-KM和CAV2-KM,确认此次犬群发病由CCV和CAV2混合感染所致.其中对CCV的分离采用含CCV和CAV2的混合感染病料攻击耐过CAV2的幼犬,导致幼犬单纯感染CCV发病后采集的病料.动物试验表明,CCV-KM株可以导致幼犬发病,具有较强的毒力;CCV-KM能被较高浓度的抗CCV1-71参考毒株的血清中和,而抗CCV-KM的血清却不能中和CCV1-71毒株,说明两者在抗原性和致病性上存在差异;基因测序结果表明,CCV-KM的M基因212 bp序列同其他已知CCV的基因序列差异较大,在进化树的位置上介于CCVⅠ型和CCVⅡ型之间,较偏向CCVⅠ型.提示CCV-KM株可能是一个新的变异株.     

犬冠状病毒核酸探针的制备及其基因序列的测定与比较

采用RT-PCR方法扩增犬冠状病毒(CCV)YS1、C11和NL-18株5′端部分S基因序列,以随机插入DNA法对CCV YS1株纯化的PCR产物标记32P同位素,制备核酸探针,并与3株CCV反转录产物杂交.用平端连接法将3株CCV PCR产物克隆于pUC19 Sma I位点或pGEM-T载体中,经PCR鉴定为正确重组质粒.以双脱氧末端终止法测定了重组质粒的cDNA核苷酸序列,并用DNASIS计算机软件进行多重比较分析,绘制系统树.结果表明,所制备的核酸探针可与3株CCV反转录产物杂交,其核苷酸序列与多株CCV相应序列的同源性高达91.9%～99.1%,为CCV的保守区.由此说明,制备的核酸探针可用于犬CCV感染的分子流行病学研究.     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

核酸探针检测犬冠状病毒方法的建立和初步应用

以^32P标记犬冠状病毒特异性RT—PCR及产物制成核酸探针，与CCV NL-18株、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、狂犬病病毒反转录产物、正常CRFK细胞以及做10～10000倍稀释的CCV NL-18株反转录产物杂交，进行核酸探针的敏感性和特异性试验。结果表明，该探针仅与CCV HLl8株反转录产物呈阳性杂交，与对照病毒和正常细胞反转录产物均呈阴性反应。初步应用试验结果，该探针可与国内CCV分离病毒YSl、CI1株杂交，且可从8份腹泻犬粪便中检出5份CCV阳性病料。本研究为在我国开展犬冠状病毒感染的分子流行病学调查和临床诊断提供了一种敏感、特异的检测方法。     

重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒（canine circovirus,CCV）在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组（CQ76、CQ79和CQ82）,全长基因组序列均为2 062 nt,与此前报道长度为2 063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5'-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5'末端间隔区和3'末端间隔区长度分别为134（1 929-2 062 nt）和203 nt（913-1 115 nt）。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2 019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。     

鹅源新城疫病毒F基因和HN基因的克隆及序列分析

为了解近年鹅群中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的流行变异情况,试验于2018年从广东地区疑似患有新城疫病死鹅的病料中分离到1株NDV,对其进行了生物学毒力测定及致病性研究,并利用RT-PCR技术扩增该分离株F基因和HN基因全长片段,进行克隆与序列分析。结果表明:分离株GD299的生物学毒力指标鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致死指数(ICPI)和6周龄静脉接种指数(IVPI)分别为58 h、1.56和2.2,F基因裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,GD299株为强毒株;F基因和HN基因核苷酸序列和氨基酸序列与参考毒株的同源性为82.9%～99.5%,属于基因群Ⅶ型,其中F基因属于Ⅶf亚型;与经典强毒株La Sota株、F48E9株氨基酸序列进行比较,F基因氨基酸序列出现多处位点变异。说明目前流行的NDV已发生一定变异。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料,进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析,为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高,为100%,软枝酸橘最低,为88.9%;随着干旱胁迫加剧,各品种的旱害指数呈上升趋势,长寿金柑的旱害指数最低,为0.25,软枝酸橘的旱害指数最高,为0.61;从叶片相对含水量的结果来看,长寿金柑的变化幅度最小,软枝酸橘的变化幅度最大,在第18d时分别为61.19%和37.85%;3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度,其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析,得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。     

重构胚移植用受体山羊同期发情处理效果比较

分别用CIDR（孕酮阴道栓）＋PMSG（处理1）和CIDR＋PMSG＋LH（处理2）两种处理方法对山羊进行同期发情处理。结果发现,两种处理均以撤栓后第1d发情率最高。撒栓后0-24h和24h-48h的发情率,处理1和处理2（61．4％,13．6％和48％,20％）之间差异不显著;撤栓后48h-72h的发情率,处理1（4．59,6）显著低于处理2（24％）（P〈0．05）;撤栓后0～72h发情率,两种处理（79．5％,92％）无显著差异（P〉0．05）。从手术时对卵巢的观察可以看出,有大卵泡或排卵的发情羊,处理1为91．2％,处理2为100％,二者无显著差异;排卵的发情羊,处理1为（58．8％）显著低于处理2为（91．2％）（P〈0．05）。