菜籽蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究

[目的]建立适用于菜籽蛋白质组研究的双向电泳技术。[方法]以湘油17号为材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、凝胶浓度、上样量等条件进行了优化。[结果]使用TCA一丙酮法提取菜籽总蛋白最佳,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数最多。当采用pH3～10IPG胶条和12％的凝胶、上样量为250μg时,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。[结论]为开展油菜种子蛋白质组学研究奠定了基础。     

苯胺降解菌蛋白质组双向电泳体系的建立与优化

为建立适合苯胺降解菌AN-P1蛋白质组学分析的双向电泳体系,对双向电泳中的上样量、IPG胶条pH值范围和等电聚焦条件进行了优化,结果表明:当上样量为2.0mg,使用24cm、pH值4～7的IPG胶条,聚焦伏小时数为110 000时,能够获取分辨率高、重复性好的凝胶图谱.     

龙眼种子蛋白质组双向电泳技术的优化

为建立适用于龙眼(Dimdcarpus longanaLour.)种子蛋白质组研究的双向电泳技术,对龙眼种子蛋白质的IEF、平衡时间及染色方法等关键步骤进行了优化。结果显示,龙眼种子蛋白质主要分布在pH4-7范围内,采用酚抽法,在聚焦达到50000 W.h的情况下能充分地聚焦,等电聚焦后经平衡缓冲液Ⅰ还原15 min,再经平衡缓冲液Ⅱ二次平衡20 min,考马斯亮蓝染色,24 cm IPG胶条上样量为1.2 mg时,在龙眼种子双向电泳图谱上检测到1000个多个蛋白点,蛋白点清晰,分辨率较好。本研究所建立的一套适用于龙眼种子蛋白质组分析的双向电泳方法分辨率和重复性较高,重复样品图谱间的相关系数在0.88-0.945之间。     

秋茄根系蛋白质组的双向电泳技术优化

建立适用于秋茄根系蛋白质组分析的双向电泳技术,并对秋茄根系蛋白质的制备、溶解、上样量、IEF及SDS-PAGE电泳等关键步骤进行优化。结果表明,应用酚抽法来提取秋茄根系蛋白,更适用于双向电泳分析;秋茄根系蛋白主要分布在pH4～7范围;裂解液中含有硫脲(2mmol.L-1)能较充分地溶解蛋白,DTT浓度为40mmol.L-1、上样量1.5mg时得到的双向电泳图谱分辨率较好,且蛋白斑点分布均匀、清晰,拖尾现象明显减少。采用与质谱兼容的考马斯亮兰进行染色,得到1 089个蛋白点。     

黄瓜根系蛋白质组分析的双向电泳技术条件优化

双向电泳(2-DE)是蛋白质组学研究的重要支撑技术之一。为建立适于黄瓜根系蛋白质组分析的双向电泳技术,对黄瓜根系蛋白质样品提取方法、裂解缓冲液配方及SDS-PAGE分离胶浓度等参数进行研究。结果表明:采用TCA/丙酮法提取黄瓜根系中的蛋白质,裂解缓冲液为8mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲、2%IPG Buffer、4%CHAPS、1%TBP、65mmol·L-1DTT、2mmol·L-1EDTA、0.001%溴酚蓝和1%鸡尾酒,SDS-PAGE分离胶浓度为11%时,可获得分离效果较好的双向电泳图谱。该技术条件为适合黄瓜根系蛋白分离的较优双向电泳体系。     

适于茭白茎部蛋白质组分析的双向电泳技术体系的建立

对茭白茎部总蛋白的提取方法,以及2-DE的条件进行了摸索比较,以期得到适合于茭白茎部组织双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法。结果表明:应用三氯乙酸(TCA)—丙酮沉淀法在研磨时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP),适当增加离心、沉淀的次数和时间,并且提高裂解浓度,可以得到浓度较高,质量较好的蛋白质样品;在蛋白含量测定中减少误差,对2-DE方法中上样量的多少、等电聚焦的程序进行优化,比较并选择染色方法,最终得到蛋白质点数目多,背景清晰,条纹较少,拖尾现象不明显的电泳图谱。     

石斛叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立及优化

以石斛叶片为材料,建立了一套适用于石斛蛋白质组分析的双向电泳体系,探讨了石斛叶片蛋白的提取、蛋白定量以及双向电泳的一些关键技术。结果表明,通过三氯乙酸(TCA)法提取、高压等电聚焦和两步平衡等方法可以获得稳定、清晰的双向电泳图谱,获得了可分辨蛋白质斑点数约613个。     

适用于甜玉米叶片蛋白质组分析的双向电泳技术

采用改良的TCA/丙酮法提取叶片总蛋白,建立了一套适用于甜玉米叶片的蛋白质组学研究方法,并对蛋白溶解液、蛋白上样量、第一向IEF等电聚焦时间等条件进行了优化.用改进的蛋白溶解液提取叶片总蛋白,明显减轻了离子干扰造成的蛋白点横拖;500μg蛋白上样量的检出蛋白点最丰富,可达750个以上;延长8 000 V等电聚焦至30 000 Vh可获得良好的蛋白点分离效果;采用优化条件后的双向电泳参数,结果重复性较高,检出蛋白点的线性回归相关系数可达0.93以上.     

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

[目的]建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础.[方法]对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条pH范围等关键步骤进行优化.[结果]采用三氯乙酸／丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 moL/L尿素,2 mol/L硫脲,4; CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液,上样量为100 mg,以pH 4 ～7、18 cm的IPG胶条在12; SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱.[结论]建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持.     

鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的优化

为探索适用于鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的方法,采用酚抽提取法对IPG胶条及蛋白质上样量等关键步骤进行优化。结果显示,鸳鸯茉莉花瓣蛋白质在p H值为4.0-7.0,24 cm IPG胶条范围分离效果较好,并且当上样量为1.5 mg时,在双向电泳图谱上检测到的蛋白点较多且清晰,分辨率较好。     

西施舌胃蛋白质组双向电泳图谱的初步构建

采用裂解、离心等抽提方法提取西施舌胃组织蛋白样品,利用bradford蛋白定量试剂盒作蛋白定量后,进行双向凝胶电泳。电泳后的凝胶采用考马斯亮蓝染色过夜,利用ImageScannerⅢ扫描仪扫描凝胶,获得凝胶图像,首次构建了西施舌胃组织蛋白的双向电泳图谱。结果显示：西施舌胃组织蛋白点主要分布在pH4～7,大部分蛋白为酸性蛋白,其中部分蛋白为高分度蛋白,在高pH区,蛋白分布相对较少。     

利用双向电泳技术分离野牛草叶片蛋白的方法研究

制备野牛草叶片蛋白质样品,对双向电泳条件等技术环节进行优化,以期获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱,建立适应野牛草叶片蛋白组学研究的技术平台,并对其蛋白组进行初步分析。采用TCA/acetone沉淀法和Trizol沉淀法分别提取野牛草叶片蛋白,通过不同聚焦时间分离,最终经硝酸银染色,以Imagemaster 2D Platinum V 5.0图像分析软件对所得的双向电泳图谱进行分析比较。对获得的最佳图谱进行蛋白点分布分析,选择最适合的胶条pH值。结果表明:Trizol沉淀法提取蛋白样品,总聚焦伏时数在8~10万V.h间,为最适合条件,获得图谱背景清晰,纵横纹少,蛋白点分离较完全,在pH3~10胶条凝胶可检测到的蛋白质点达到800个。对蛋白点pH分布范围分析表明,85%蛋白点分布在pH4~7之间,选择pH4~7的IPG胶条,能检测到1 000个以上的蛋白点。以Trizol沉淀法结合优化的双向电泳参数对野牛草叶蛋白组进行双向电泳分离,获得了高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱,可用于野牛草差异蛋白质组学研究。     

苗期夜间低温处理对番茄叶片蔗糖代谢的影响

[目的]探讨夜间低温处理对番茄叶片蔗糖代谢的影响。[方法]以夜温15℃为对照,设夜温6℃（18：00—6：00）为处理,处理7d后测定番茄叶片糖和淀粉含量及蔗糖代谢相关酶活性。[结果]夜间低温处理增加了叶片中的果糖、葡萄糖、蔗糖、总糖和淀粉的含量,果糖和葡萄糖含量与对照相比差异不显著,蔗糖、总糖和淀粉含量与对照相比差异达极显著水平;夜间低温处理增加了叶片中酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）活性,降低了蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性。[结论]夜间低温导致番茄叶片中光合产物积累,对光合作用产生反馈抑制。     

肺炎链球菌蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

为了建立适合肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白质组的双向电泳技术,对蛋白样品提取、裂解、上样量、IEF和银染等关键步骤进行了优化,探索出一套有效的肺炎链球菌蛋白分析的双向电泳方法,即以裂解液[15 mmol/L Tris-HCl、7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(m/v)CHAPS,使用前现加2%(v/v)IPG缓冲液、1%(m/v)二硫苏糖醇(DTT)和1%(m/v)蛋白酶抑制剂混合物]结合反复冻融和超声裂解菌体的方法来提取蛋白质样品,按80μg蛋白上样量,并结合适宜的双向电泳参数,可获得蛋白分辨率高、重复性较好的双向电泳图谱。     

红豆杉细胞蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

[目的]探索适用于红豆杉愈伤蛋白质组学研究的样品制备方法。[方法]以红豆杉愈伤组织为材料,分别采角三氯乙酸（TCA）／丙酮沉淀法、Tris—HCl法和酚-甲醇／醋酸铵沉淀法提取其中的总蛋白,通过双向电泳（2DE）检测3种方法对总蛋白的提取效果。[结果]3种方法提取的蛋白样品2DE图谱显示的蛋白点数量均较多。TCA／丙酮沉淀法对蛋白质的提取率较高,2DE图像清晰,条纹少,拖带现象轻;Tris—HCl法提取的蛋白样品2DE图谱个别区域出现较轻的云片状聚集,并有轻微拖带现象;酚-甲醇／醋酸铵沉淀法提取蛋白样品的2DE图谱有条纹和拖带现象。[结论]TCA／丙酮沉淀法提取的蛋白质质量较高,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量大。     

双向电泳技术在植物蛋白质组研究中的应用

双向电泳技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段,是蛋白质组学研究的核心技术之一。综述了双向电泳技术的原理、主要操作方法及其在植物蛋白质组研究中的应用。     

金鱼胚胎蛋白质双向凝胶电泳方法建立及优化

以金鱼胚胎为材料,以不同样品制备方式、裂解液成分、固相pH梯度胶条的选择、凝胶浓度为侧重点,建立并优化金鱼胚胎总蛋白质组最佳双向凝胶电泳技术条件.研究表明,采用匀浆器匀浆含硫脲和NP-40裂解液提取蛋白,应用pH值为3～10的非线性IPG胶条和浓度14%的SDS-PAGE凝胶进行双向电泳,经优化电泳电流、时间等参数后,获得了重复性和分辫率理想的金鱼胚胎总蛋白质双向电泳图谱,为金鱼胚胎蛋白质组分析莫定了基础,为揭示金鱼单倍体发育异常的机制提供了技术保障.     

蜂蜜蛋白提取以及双向电泳技术分析蜂蜜蛋白条件优化

[目的]研究蜂蜜中蛋白质提取的有效方法,优化蜂蜜蛋白电泳条件。[方法]该试验使用丙酮、钨酸钠、硫酸铵、尿素-硫脲4种方法提取蜂蜜中的蛋白并进行比较,然后进行双向电泳分析,对影响双向蛋白电泳的IPG胶条的选择、蛋白质上样量、等电聚焦时间等主要因素进行优化。[结果]试验表明,采用硫脲法提取蜂蜜蛋白获得的蛋白含量最高,硫脲法和丙酮沉淀法获得的蛋白纯度最好,而硫脲法因干扰物质较少、易于裂解适于双向电泳技术,采用硫脲法提取的蜂蜜蛋白选择IPG胶条p H 5~8,蛋白上样量为150μg,等电聚焦时间达到32 000 V·h的情况下能充分地聚焦,获得的双向电泳图谱最佳,优化后的洋槐蜜双向电泳图谱上可检测到326个蛋白点,重复性和分辨率均较好。[结论]蜂蜜类含糖样品中使用硫脲法提取蛋白能减少糖类物质干扰。     

文冠果枝条韧皮部蛋白质双向电泳体系的建立

以文冠果当年生硬枝韧皮部为材料,通过TCA/丙酮法提取总蛋白,研究了不同的蛋白质裂解液组成对双向电泳的影响,并在胶条选择、蛋白质上样量和等电聚焦时间等方面进行了优化。结果表明,TCA/丙酮提取法适用于提取文冠果韧皮部组织总蛋白,得到的图谱背景低,蛋白质点清晰;样品溶解于含有尿素和硫脲的蛋白质裂解液Ⅱ中,可显著地提高蛋白质的溶解性,获得的总蛋白溶液浓度远大于裂解液Ⅰ提取的总蛋白溶液浓度。在适宜的时间范围用超声波破碎仪处理蛋白质粉溶液有助于大幅度提高裂解液中蛋白质的浓度。等电聚焦条件宜根据样品特性选择,80 000Vh能够使得文冠果韧皮部蛋白质双向凝胶碱性端的横条纹大大减少。