葡萄卷叶病毒RT-PCR检测技术研究

以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA和dsRNA提取方法进行了研究,从中筛选出了提取葡萄总RNA和dsRNA的适合方法。建立了GLRaV RT-PCR的有效体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR主要成分对RT-PCR的影响,确立了GLRaVRT-PCR的优化体系。     

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ基因的克隆及序列分析

根据葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ美国分离物的ＧＬＲａＶ－３ＣＰ基因序列,设计并合成了１对该病毒的ＰＣＲ引物,利用ＩＣ－ＲＴ－ＰＣＲ成功地检查到合适大小的ＰＣＲ产物;同时将ＰＣＲ产物克隆到中间载体ＰＧＥＭ－３Ｚｆ,转化大肠杆菌ＤＨ５α菌株,筛选阳性克隆。通过双酶切以及序列分析表明,扩增样品与美国分离物的同源性为９４．１％。     

葡萄卷叶病毒RT-PCR检测技术研究

以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA和dsRNA提取方法进行了研究,从中筛选出了提取葡萄总RNA和dsRNA的适合方法. 建立了GLRaV Ⅲ RT-PCR的有效体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR主要成分对RT-PCR的影响,确立了GLRaV RT-PCR的优化体系.     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌

为建立创伤弧菌的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法,根据编码创伤弧菌DNA促旋酶的B亚单位蛋白(Gyrase Beta Subunit,gryB)的基因保守序列,设计RPA特异性引物,建立创伤弧菌gryB基因的RPA检测方法并测试其特异性、灵敏度和应用效果。结果发现,建立的RPA检测方法特异性好,能够从创伤弧菌中检测到234 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40 min,不需要特殊的仪器设备;该方法的灵敏度与PCR相当,可达到0.1 ng/μL,应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当。因此,本研究建立的RPA方法检测gryB特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室快速检测。     

葡萄卷叶病毒主要检测技术比较

葡萄卷叶病(GLRaV)是葡萄上的一种重要病毒病害。本文主要阐述了该病的病原、分布及近些年来各种检测技术在该病检测中的应用情况,分析了各种检测技术的优势和不足及如何在该病检测中对各种方法做合理的搭配应用,优势互补,提高效率。     

宁夏地区葡萄卷叶伴随病毒遗传变异的PCR-SSCP分析

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病病株率较高,严重影响了酿酒葡萄产业的健康发展,但有关其病原葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus, GLRaVs)的遗传变异情况则鲜有报道.利用RT-PCR技术对宁夏酿酒葡萄不同种植区的7个主栽品种的GLRaV-1和GLRaV-3进行分子检测,利用SSCP技术对扩增片段进行遗传变异分析.试验结果共获得8个GLRaV-1和13个GLRaV-3的阳性样本. 8个GLRaV-1分离物基于CP基因分析差异明显,可分为3类; 13个GLRaV-3分离物基于RdRp基因分析差异明显,可分为3类,而基于CP和HSP70基因分析可分为2类.说明宁夏酿酒葡萄不同种植区、不同品种的GLRaV-1和GLRaV-3种群分子特性存在差异且遗传变异明显.这有助于宁夏地区酿酒葡萄GLRaVs流行学调查和分子诊断分析,为该病害的防控提供理论依据.     

IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的研究

结合ELISA和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的特点,引入了另外一种方法,即免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)对葡萄卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了检测。从免疫捕捉病毒、释放RNA到反转录成cDNA,最后扩增出了约300bp的预期目的片段。为了进一步明确PCR扩增的特异性,将PCR产物连接到pGEM-T载体上,转化大肠杆菌E.coliJM109菌株,通过蓝白斑筛选,获得重组质粒,提取质粒DNA,经酶切对重组质粒进行鉴定,结果得到了含有目的片段的重组质粒。由此证明,IC-RT-PCR检测GLRaV-3结果准确可靠。最重要的是它弥补了ELISA易出现假阴性、假阳性以及RT-PCR提取RNA难等的缺点,不失为病毒检测的新型方法。     

葡萄卷叶伴随病毒ⅢCP基因在E.coli中的表达

将葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ的CP基因克降到表达载体pET-30a中，转化大肠杆菌BL21，筛选得到阳性克隆GB－1，用IPTG诱导使其表达。SDS－PAGE电泳分析表明，该CP基因在大肠杆菌BL21中得到大量表达。用该病毒的CP抗血清通过间接ELISA证明所表达的蛋白具有很好的抗原性。     

甘肃葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的检测

采用 DAS-ELISA 检测方法对甘肃地区的葡萄主要品种进行扇叶病毒和卷叶病毒的调查和测定。结果表明,这两种病毒病在甘肃地区的主要葡萄产区均有发生。兰州地区和一些老的葡萄产区葡萄带病毒病较严重。通过对比植株下部枝条的幼叶、幼茎、老叶和老茎病原的检测结果,说明植株下部幼嫩组织是卷叶病毒最适的检测部位。     

葡萄卷叶伴随病毒ⅢCP基因在E.coli中的表达

将葡萄卷叶伴随病毒 的 CP基因克隆到表达载体 p ET- 30 a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1,筛选得到阳性克隆 GB- 1,用 IPTG诱导使其表达。SDS- PAGE电泳分析表明 ,该 CP基因在大肠杆菌 BL2 1中得到大量表达。用该病毒的 CP抗血清通过间接 EL ISA证明所表达的蛋白具有很好的抗原性     

重组酶聚合酶扩增技术及其在生命科学领域的应用

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术,与传统的聚合酶链式反应(PCR)相比具有反应时间短、操作简单、灵敏度高、特异性强的优点。为促进人们对RPA技术的深入了解,并探索更加成熟的应用方法,本文综合已有文献,介绍了该技术的反应原理、产物检测方法、应用情况、技术特点,并对其进行了展望,以期为RPA技术的完善提高和推广应用提供参考。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在生命科学领域的应用

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术,与传统的聚合酶链式反应(PCR)相比具有反应时间短、操作简单、灵敏度高、特异性强的优点.为促进人们对RPA技术的深入了解,并探索更加成熟的应用方法,本文综合已有文献,介绍了该技术的反应原理、产物检测方法、应用情况、技术特点,并对其进行了展望,以期为RPA技术的完善提高和推广应用提供参考.     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

基于链替代扩增-纳米金比色直观检测单链核酸方法的研究

[目的]将链替代扩增技术与核酸修饰纳米金积聚变色的光学特性相结合,设计了一种新型的直观检测3′端暴露单链核酸的方法,实现对单链核酸的高灵敏度检测。[方法]设计一条含有硫代修饰酶切位点的单链核酸（ZDNA）,其酶切位点5′端是能将核酸修饰纳米金变色的Linker序列,3′端是能与Target单链核酸3′端完全互补的H序列。当无Target存在时,Linker会充分暴露,能使核酸修饰纳米金积聚呈现紫色;但是当Target存在时,会与H序列完全互补,作为ZDNA的引物进入链替代扩增循环,形成的新链不断与Linker序列互补,不能使核酸修饰纳米金积聚呈现红色,从而间接检测了Target单链核酸。[结果]通过一系列试验确定检测体系,具体为：40μl修饰纳米金溶液（0.52 nmol/L）加入10μl酶循环体系（ZDNA20 nmol/L,33 mmol/L Tris-HCl（pH值7.9）;10 mmol/L MgCl2;66 mmol/LNaCl;0.5 mmol/LdNTP;0.1 mg/ml BSA;0.05 U/μl klenow;1 U/μl Hinc II）,直观或紫外检测并绘制Target浓度与纳米金积聚程度的标准曲线,表明Target浓度在1~200 pmol/L的范围内呈现良好的线性关系,R2=0.946,最低检测限是1 pmol/L。[结论]链替代扩增-纳米金比色检测单链核酸方法简便、直观、成本低,与传统修饰纳米金比色检测DNA方法相比,灵敏度提高了104倍。     

LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

重组Tgo DNA聚合酶最适扩增条件的研究

以重组TgoDNA聚合酶为研究对象,检测了其最适扩增条件。结果表明:该重组酶的最适pH为8.75,最适Mg2 浓度为2.0 mmol/L,最适延伸温度为71.9℃。利用该重组酶成功扩增了质粒pUC19、野大麦Na /H 逆向运转蛋白基因、拟南芥Timeless基因、小鼠Cx37基因和人CYT2C9基因。     

棉花皱叶病毒LAMP检测方法的建立

棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是危害棉花的重要病毒之一,属中国进境检疫性植物病毒,本研究根据其DNA-B基因序列设计LAMP特异性引物,通过试验建立CLCrV的LAMP检测方法。该方法检测快速,15min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同属的CLCrV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)及番茄黄化曲叶病毒(TYLCV);灵敏度高,可检测到约43fg/μL的总DNA,比普通PCR灵敏度高1 000倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应进行结果判断。该方法适用于现场CLCrV的快速检测。     

猪·牛·羊源性成分实时等温扩增检测方法的建立

[目的]建立一种快速检测猪、牛、羊动物源性成分的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。[方法]针对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因分别设计LAMP引物,通过实时检测荧光强度判断反应结果。[结果]猪、羊源性成分的检测灵敏度为10 pg,牛源性成分的检测灵敏度为1 pg。对模拟掺杂肉制品检测时,掺杂猪肉、牛肉、羊肉的检出限为0.01%。[结论]该研究所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对肉制品掺杂的猪、牛、羊源性成分进行检测,可作为肉类鉴别的一种快速检测方法。