谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35在水稻中对盐胁迫的响应

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】 选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系（over-expression,OE）-1（OE-1）、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L ^-1 NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L ^-1 NaCl处理3 d后苗长及根长;用150 mmol·L ^-1 NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑（nitrotetrazolium blue chloride,NBT）染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。 【结果】 谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L ^-1NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L ^-1 NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O ^2-和H₂O₂的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。 【结论】 谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。     

水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达

水稻类受体蛋白激酶Os ESG1在种胚中特异表达,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Os ESG1基因全长c DNA经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切,与同样经双酶切的原核表达载体p ET-28a(+)经T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21。原核表达结果显示,Os ESG1可受1 mmol/L IPTG诱导表达,且蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,诱导7 h后,蛋白表达至较高水平。对不同浓度IPTG诱导下的蛋白表达情况进行研究,结果显示,0.1 mmol/L IPTG对Os ESG1的诱导表达效果最好。     

花生共生受体类蛋白激酶基因的克隆及生物信息学分析

共生受体类蛋白激酶（symbiosis receptor-like protein kinase, SYMRK）是控制植物与微生物共生的关键调控基因,利用基因组步移技术,克隆得到花生symrk的全长基因及其560 bp的ATG上游序列。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的常规理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和高级结构等进行了预测和分析,结果表明Ah-symrk由15个外显子和14个内含子组成,cDNA全长3 042 bp,包含2 781 bp的ORF,编码926个氨基酸,为疏水性酸性蛋白质,定位于细胞膜;ATG上游序列包含3个与根特异表达有关的顺式作用元件root motif tapox1;RT-PCR验证,该基因在花生根中特异性表达。     

类法尼醇X受体α基因的原核表达及多克隆抗体制备

根据NCBI上公布的序列设计引物,从Hep G2细胞系中克隆了FXRα的开放阅读框(ORF),构建原核表达载体p ET-28a-FXRα,转化E.coli BL21(DE3),经1.0 mmol·L-1IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,成功诱导FXRα蛋白;以镍柱亲和层析纯化获得FXRα蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体。Western Blot分析表明:制备的多克隆抗体能够特异识别重组蛋白,为深入研究此受体的功能及新药发现奠定了基础。     

花生NBS-LRR类抗病基因的克隆及原核表达

根据已知抗病基因的NBS保守区域设计引物,利用PCR技术从花生基因组DNA中克隆得到一个NBS-LRR类抗病基因,序列长539 bp,命名为PnAG3。蛋白质序列同源性分析表明多个植物抗病相关蛋白与之有一定的同源性,其中同源性最高的是花生C8_V_253抗性蛋白序列（97%）。将PnAG3基因编码区构建原核表达载体,表达产物分布于包涵体中,大小为47.26 KDa,1 mmol/L IPTG诱导4 h可获得最大表达量。为花生抗黄曲霉品种选育奠定了基础。     

谷子胁迫诱导型启动子SiRLK35P的分离及生物信息学分析

本研究以谷子"豫谷1号"为材料,结合相关数据库检索,以谷子幼苗提取的基因组DNA为模板,经PCR特异扩增SiRLK35上游1 893 bp调控序列,命名为SiRLK35P。结合PLACE数据库,对SiRLK35P进行生物信息学分析,并对其诱导表达情况进行了预测。结果显示,SiRLK35P中含有ABRELATERD1(ACGT)、GCCCORE(GCCGCC)等多种顺式作用元件,部分元件已知与不同逆境胁迫及应答相关,预测该启动子可能参与谷子胁迫响应,调控下游基因在胁迫等逆境条件下的表达水平,从而对谷子在胁迫下的应答进行调控。该研究为定向改良谷子抗逆特性、培育谷子抗逆新品种提供了候选材料。     

紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

水稻类受体蛋白激酶FTPK1的原核表达及其活性检测

类受体蛋白激酶(receptor-like kinase,RLKs)是植物信号分子的受体,它能够通过胞内激酶域对底物进行磷酸化或去磷酸化,从而对下游靶基因的转录及表达进行调控,参与胞内信号转导,在植物生长发育及环境应答过程中发挥作用。本研究以水稻"中花11"cDNA为模板,通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因FTPK1的全长序列,进一步构建原核表达载体p ET-28a-FTPK1后,经1 mmol/L IPTG诱导12 h,获得88k D的诱导表达蛋白条带,显示FTPK1可在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经Ni柱纯化及透析后,获得纯化的融合蛋白。FTPK1激酶活力检测显示,其可磷酸化蛋白底物His和MBP,具有一定的磷酸化活性。本研究为进一步制备FTPK1特异性抗体,深入解析其理化特性及生物学功能奠定了基础。     

香蕉类受体蛋白激酶基因的克隆及杂交鉴定(英文)

[目的]克隆鉴定香蕉类受体蛋白激酶基因。[方法]以香蕉果实cDNA噬菌体文库为材料,筛选出香蕉类受体蛋白激酶基因阳性噬菌体库,对该基因进行克隆和序列分析,并通过原位杂交方法对其进行鉴定。[结果]试验克隆到1个长度为1698bp的香蕉果实类受体蛋白激酶基因,编码563个氨基酸序列。经过Southern杂交证实该基因来自香蕉基因组,是1个多拷贝基因。[结论]该研究结果为进一步研究香蕉类受体蛋白激酶基因在香蕉果实中的功能奠定了基础。     

油菜COR基因的克隆及原核表达

以冬油菜陇油6号叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因编码区序列,全长390 bp。将其与大肠杆菌表达载体p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-COR,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约14.3 k D的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

人瘦素基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR从人的脂肪组织中克隆了人OB基因,并将其在原核生物E.coli BL21(DE3)中重组表达,采用SDS-PAGE法检测表达情况,鉴定表达产物。结果表明,人瘦素在大肠杆菌中表达量占总蛋白的20%左右,为瘦素的进一步研究奠定了基础。     

香蕉PPO基因的克隆及原核表达

为进一步在蛋白水平上研究香蕉PPO功能及获得抗酶促褐变的香蕉新品种,通过PCR从巴西蕉中扩增出多酚氧化酶基因(PPO)全长序列,并进行进化树分析与SDS-PAGE电泳检测。结果显示:多酚氧化酶基因全长1 767bp,编码588个氨基酸,GenBank登录号为KF900300.1。与其他物种PPO基因的氨基酸序列有很高的结构相似性,并同时具有保守结构域CuA和CuB,香蕉PPO蛋白与菠萝亲缘关系最近。另外,成功构建原核表达载体pQE80L-MaPPO1,并转化E.coli M15,但未表达出目的蛋白,推测可能与MaPPO1中存在导肽有关。     

35S的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR技术和基因克隆方法对35S基因进行了分子克隆和序列分析,同时,利用PET-28a 构建了35S基因的原核表达载体,为抗体的制备以及在蛋白水平上检测转基因植物奠定基础.     

谷子丝/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)类抗病基因保守结构域设计简并引物,以抗锈病谷子品种十里香和感锈病谷子品种豫谷1号为材料,利用抗病候选基因(RGA)技术对谷子STK类抗病基因同源序列进行克隆和分析,以期为谷子抗锈病相关基因的克隆及抗锈机制的研究奠定基础。结果表明,从抗病材料中获得1条STK类似序列(STK 1),长度为474bp。BLASTP分析表明,该序列含有PKc保守结构域,且与小麦抗锈病激酶Lr10、水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体PR5K、玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体1、燕麦激酶受体LRK10等同源性在71%～76%。从谷子抗锈品种十里香中获得的STK类抗病基因同源序列可能是候选的谷子抗锈病相关基因。     

甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的克隆、表达及遗传转化分析

【目的】本文研究了蛋白激酶类基因在甜瓜白粉病抗性中的抗性机理。【方法】以不同抗性的甜瓜为材料,根据植物蛋白激酶类基的同源序列设计引物,采用RT-PCR方法获得该基因的中间部分序列,通过RACE法获得c DNA完整序列,将其命名为CmPKC。【结果】该基因全长约为2914 bp,开放阅读框为2493 bp,编码831个氨基酸。蛋白序列进化分析表明,CmPKC蛋白与香瓜蛋白激酶同源性最高。实时荧光定量PCR分析表明在不同抗性材料上相对表达量变化趋势不同,在抗性材料上表达丰度出现的时间较感病材料早,且在不同材料上相对表达量变化趋势与已报道的一个甜瓜感病相关MLO家族基因一致,推测所获得的基因也可能与感病相关,且属于早期应答基因;转基因烟草鉴定初步表明该基因可能还参与生长发育过程,具有促进开花的功能。【结论】将为更加深入探索其功能及在白粉病抗性通路中及生长发育过程中所起的作用奠定基础。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

[研究目的]植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义.[方法]提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA全长序列,并对该序列进行分析.将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达.[结果]克隆到的BanLec cDNA序列为460 bp,开放读码框为426 bp,编码142个氨基酸.与其他已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上.SDS-PAGE分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD.[结论]该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础.     

鸡催乳素受体胞外域的分子克隆及原核表达

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌Ecoli DH5α永久保存．通过设计第2对引物扩增PRLR胞外域cDNA片段，该片段经酶切后克隆到表达载体pRSETA的EcoRⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组质粒pR-PRLR．该质粒在转化感受态细菌E．coli B121（DF．3）后，在IPTG诱导下促使重组菌表达了相对分子质量为53640左右的重组融合蛋白，表达量在0．1mmol／L IPTG诱导5h时达到最高，约占总菌体蛋白的17．6％左右．表达产物可经体积分数为50％的Ni-NTA凝胶纯化，说明重组蛋白中具有正确的His-tag标签及之后的鸡催乳素受体编码区胞外域序列．     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。