锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

为建立快速有效的锦鲤疱疹病毒病检疫方法,根据锦鲤疱疹病毒(KHV)聚合酶基因(Sph)的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针,建立了一种快速检测锦鲤疱疹病毒病荧光PCR方法。用建立的检测方法对细胞培养物进行检测,并与常规PCR对比,结果荧光PCR灵敏度高于普通PCR,能检出的最低拷贝数为1.6×102/μL。应用该方法对样品进行检测,结果表明:所建立的荧光PCR检测方法4 h内可报告检测结果。该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等特点,适用于锦鲤疱疹病毒的快速检疫。     

江苏地区1株锦鲤疱疹病毒的鉴定

对我国江苏地区养殖锦鲤暴发性鲤疱疹病毒病(koiherpes virus disease,简称KHVD)的病原进行鉴定。2018年5月,江苏省一锦鲤养殖场暴发不明原因传染疾病,病鱼肝、脾、肾脏中未分离到细菌。透射电镜观察发现大量球状病毒粒子。提取自然发病鱼的鳃、肾、脾、肝组织DNA作为模板进行PCR检测,结果显示为阳性。Blast比对结果显示,扩增序列与锦鲤疮疹病毒(koi herpesvirus,简称KHV)胸苷激酶(thymidine kinase,简称TK)基因和KHV DNA聚合酶(SPH)基因核苷酸序列同源性为99%。对病毒株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲型毒株。     

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析

提取感染锦鲤疱疹病毒(KHV)的锦鲤(Cyprinus carpio koi)肾脏组织DNA,通过PCR扩增了KHV ORF132基因。该基因全长513 bp,所编码的蛋白包含170个氨基酸,分子量18.5 ku,等电点8.11,有信号肽以及2个潜在的O糖基化位点。应用DNA Star程序,通过综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性、抗原性指数,预测KHV ORF132蛋白主要B细胞表位区段位于Leu40～Ala45、Asn53～Pro66、Arg97～Thr118、Ala125～Pro136、Glu140～Arg145、Asn160～Arg170。     

几种动物生鲜肌肉组织样品DNA提取方法的比较研究

比较不同提取原理的试剂盒对动物生鲜肌肉组织DNA提取效果,为日常肉制品掺假检测与监测选择合适的DNA提取方法提供参考。以生鲜牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉为试验材料,采用改良CTAB法、蛋白酶K法、SDS法和快速萃取法等原理的8种不同方法来提取组织样品DNA,并对提取DNA的完整性、浓度、纯度、试验耗时和后续实时荧光定量PCR检测等指标进行评价。结果表明,8种提取方法均可用于常见动物源性肌肉DNA的提取。与改良CTAB法相比,原理为蛋白酶K法、SDS法和快速萃取法的试剂盒避免了有机试剂的使用,且操作耗时短。实际操作中,可优先选择基于蛋白酶K法和SDS法的试剂盒进行DNA提取,其提取的DNA纯度和总量高,盐残留少,对实时荧光定量PCR的抑制少,满足肉制品掺假检测与监测的核酸提取需求。     

高效提取肠道菌群总DNA方法的建立

[目的]建立一种高效快速的提取肠道茵群总DNA的方法,即改进的氯仿抽提法,为进一步对肠道茵群的定性和定量提供基础。[方法]通过对多种肠道菌群总DNA提取方法的考察总结,对氯仿抽提法进行改进,采用细菌添加试验的荧光实时PCR检测抽提结果,同时与QIAamp DNA Stool Mini kit法进行比较,以验证所建立的改进的氯仿抽提法的高效性。[结果]改进的氯仿抽提法提取的肠道茵群总DNA量约是QIAamp DNA Stool Mini kit的100倍;同时细菌添加试验的实时荧光定量PCR结果显示,改进的氯仿抽提法提取添加细菌的DNA效率较高。[结论]改进的氯仿抽提法经济、高效、快速,适合大批量的粪便样品的DNA提取。     

对虾病毒 DNA／RNA 的实时荧光定量RT PCR 同步检测方法研究

为建立同步检测对虾DNA/RNA病毒的实时荧光定量反转录PCR（RTPCR）方法,提高检验检疫工作效率,探索了一种新的实时荧光定量PCR扩增反应程序。结果显示,应用优化的实时荧光定量RTPCR检测4种对虾病毒（白斑综合症病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒,桃拉综合征病毒、黄头病毒）DNA/RNA,扩增曲线形态典型,扩增效率理想（E值分别为1.06、1.07、0.92、0.92）,标准曲线线性良好（r＝1）,重复性一致（标准差0.05～0.46,变异系数0.26％～1.62％）,灵敏度高,且与实时荧光定量PCR相比差异不显著（平均Ct值误差0.04～0.40,t值0.53～2.50,P＞0.05）,检测时间约1h。优化的荧光定量RTPCR可以用于4种对虾病毒DNA/RNA的快速定量检测。     

实时荧光定量PCR法测定禽蛋中沙门氏菌

为建立禽蛋中沙门氏菌的荧光PCR法检测方法,根据invA基因序列设计实时荧光定量PCR引物和探针,常规方法提取菌体DNA,以55℃为退火温度进行荧光PCR扩增,并进行方法学考察。结果表明:阳性对照品和沙门氏菌为模板的样品有明显扩增曲线,其他菌株为模板的样品无扩增曲线,特异性、灵敏度和重现性考察提示实时荧光定量PCR方法符合检测方法学要求。实时荧光定量PCR法的应用,提高了禽蛋制品中沙门氏菌检测的灵敏度、缩短了检测时间、简化了检测流程。     

进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定

为了查明锦鲤暴发性疾病的病因，将患病锦鲤的脑，肝，脾和肾等组织悬液接种到CO，CK和EPS等鱼类细胞系中培养，均未发现细胞病变，从病灶中取样进行病原菌的分离和培养，证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染，制备锦鲤疱疹病毒（KHV）的2对引物KHV9/5F和KHV9/5R，KHV1和KHV2，用嵌套式聚合酶链式反应（nested-PCR)在脑和脾脏组织的抽提物中扩增出长度为412bp的特异性的DNA片段，将该片段的nested-PCR拉增产物纯化后，克隆，测序，用NCBI-Blast软件将测序结果，在Genebank中进行搜寻，比较，结果发现与注册号为AF411803的KHV基因序列的一部分片段有99%的同源性，因此初步判断这次锦鲤暴发性疾病是由KHV引起的，副溶血弧菌和嗜水气单胞菌起着继发感染的作用。     

锦鲤疱疹病毒潜伏感染实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异和敏感的检测锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)潜伏感染的方法,以KHV Sph基因为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立Real–Time PCR检测方法,并且对该方法进行特异性和敏感性评估及临床样品应用研究。结果显示:建立的方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鲡疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为42拷贝/μL,灵敏度高。用本方法对63份临床样品进行检测,有锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病史的18份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;从有临床症状的鱼中得到的15份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;30份无任何临床症状鱼中的6份被检测为阳性,阳性率为20%。本试验中建立的水生动物疱疹病毒潜伏感染快速检测方法,可为潜伏感染KHV的临床检测提供一种快速、敏感和特异的检测手段,可为KHVD的分子流行病学调查和预防提供参考。     

应用实时荧光定量PCR法检测仔猪肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌

应用实时荧光定量PCR法对1月龄仔猪粪便中所含的乳酸杆菌和双歧杆菌进行定量检测,揭示肠道相关菌群改变在仔猪腹泻发病中的作用及意义,研究分别设计乳酸杆菌和双歧杆菌的特异性引物和探针,收集仔猪出现腹泻症状的粪便样本30份及正常对照样本30份,提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR检测细菌的数量。结果表明,仔猪出现腹泻症状的粪便组乳酸杆菌和双歧杆菌的数量较正常对照组明显减少,差异有统计学意义。表明肠道菌群与腹泻的发生有一定的关系。     

青枯菌定量检测方法的建立及其在花生中的应用

[目的]建立快速、准确的青枯菌定量检测方法,研究青枯菌与寄主植物的互作.[方法]以青枯菌hrpB为靶基因,利用实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)方法建立青枯菌的定量检测方法,并利用该方法检测花生接种青枯菌后细菌数量的变化动态.[结果]以提取的细菌DNA为模板和以青枯菌的全细胞为模板均能对青枯菌准确定量,在未富集细菌的...     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

实时荧光定量PCR在植物病害中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一项新兴技术,越来越受到人们的重视.它以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域,近年来,实时荧光定量PCR技术在植物病害研究上不断深入,大大提高了植物病害的检测效率和监测防治水平.结合了最近几年来应用于检测和鉴定植物病原病害的实时荧光定量PCR过程中引物与探针的设计、反应过程、结果评价情况,综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒、线虫引发的植物病害的检测与应用.     

荧光定量PCR检测猪肝中猪链球菌2型的基因组DNA提取方法的比较

[目的]在人工布菌猪肝中评估溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法提取猪链球菌2型基因组DNA在荧光定量检测中的应用效果,为猪链球菌2型的荧光定量检测选择合理的基因组DNA提取方法提供试验依据。[方法]采用溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法分别提取人工布菌猪肝样本中猪链球菌2型基因组DNA,通过荧光定量PCR技术检测猪链球菌2型的相对含量。[结果]利用荧光定量方法能够检测到猪链球菌2型。该方法可以最低检测到12 CFU/g的猪链球菌,特异性良好,标准曲线方程为y=-3.185 9x+39.901 0。在人工布菌猪肝样本中,溶菌酶-苯酚法在q PCR实验中检测猪链球菌2型较灵敏。[结论]溶菌酶-苯酚法在猪肝样品中提取基因组DNA效果较好;试剂盒法在细菌纯培养物中提取基因组DNA具有安全、高效等优点。     

采用实时荧光定量PCR技术比较提取土壤真菌DNA方法的差异

[目的]采用实时荧光定量PCR技术比较手提方式和OMEGA微量土壤DNA提取试剂盒获得土壤中真菌DNA的差异。[方法]接种5个梯度稀释的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）菌丝到灭菌土壤中,并设置不接种的样品为阴性对照。采用手提方式和OMEGA土壤微量DNA提取试剂盒分别提取制备的土壤样品,采用实时荧光定量PCR方法和辣椒疫霉菌的特异性引物对土壤样品中的辣椒疫霉菌进行定量,并对结果进行比较,分析两种方法的特点。[结果]手提方式和试剂盒方式获得的土壤真菌DNA受土壤中杂质的影响较小,并且均能获得适合实时荧光定量PCR技术的模板DNA。采用试剂盒方式获得的辣椒疫霉菌定量结果比手工提取方式获得的辣椒疫霉菌定量结果平均高2.78倍。[结论]采用OMEGA微量土壤DNA提取试剂盒方法获得的菌体基因组DNA的量较多,定量结果更精确;手提方法所需试剂均为常用生化试剂,方便获得且价格低廉。因此,两种方法各有优势,可以根据实际情况选择。     

白木香愈伤组织与叶片DNA快速提取方法的确定

[目的]确定白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法.[方法]用TE、ES1、ES2 3种提取液及相应的方法提取叶片和愈伤组织总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取产物,通过普通PCR及荧光定量PCR检查DNA的可用性,并将PCR产物经克隆测序验证.[结果] ES1法提取的叶片和愈伤DNA条带清晰,纯度较高;普通PCR和荧光定量PCR可扩增出200和600bp左右的目的条带.ES2法提取液电泳不能检测到DNA条带,但PCR可扩增出愈伤组织200bp左右目的条带.TE法得到的提取液检测不到DNA条带且PCR不能得到目的条带.[结论] ES1提取液及相应的提取方法可用于白木香愈伤和叶片DNA高通量快速提取,为沉香属植物种质研究和分子研究奠定基础.     

嗜水气单胞菌的检测方法比较

[目的]比较实时荧光定量PCR法、PCR法及细菌培养法检测嗜水气单胞菌的灵敏度与特异性。[方法]在常规PCR法的基础上设计并建立了实时荧光定量PCR法,并采用该法与常规PCR及传统细菌培养法3种方法同时对嗜水气单胞菌进行检测与比较。[结果]实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达12.5 cfu/ml,达到了只需13个细菌就可得到阳性结果的灵敏度,具有很高的特异性,且检测速度快,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,比传统细菌培养法和常规PCR法所需时间大大缩短。实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染。[结论]实时荧光定量PCR检测是3种方法中最为快速敏感的方法,是一种比较实用的嗜水气单胞菌的检测方法。     

实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来,实时荧光定量PCR技术在植物检疫研究上不断深入,大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。     

浅谈基层开展荧光PCR试验的注意事项

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,该技术体外可在短时间内通过DNA扩增反应获得大量特定目的基因片段,通过DNA基因追踪系统,能迅速掌握体内的病毒含量,其精确度高达纳米级,而实时荧光定量PCR则是一种在DNA扩增反应中,通过荧光信号对PCR进程进行实时检测,在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,成为定量的依据。实时荧光定量PCR具有敏感、快速、高通量、简便、自动化程度高等突出优势,目前已在兽医实验室中广泛应用,但该实验环境条件、技术水平要求高,且影响结果的因素众多,容易出现假阳性及假阴性的结果,导致检测结果不准确。本文从检测过程的各个环节分析存在的影响因素,提出消除影响因素的方法,提高检测结果的准确性。     

3种试剂盒提取烤后烟叶DNA的效果比较

【目的】筛选出简单、快速及高效的烤后烟叶DNA提取试剂盒。【方法】选用3种不同的DNA提取试剂盒提取烤后烟叶DNA,通过比较DNA的纯度和浓度、实时荧光定量PCR扩增Ct值以及凝胶电泳图谱分析的方法,综合评价DNA提取效果。【结果】AxyPrep基因组DNA小量试剂盒所提取的DNA,其纯度和浓度较高,用时短,DNA质量好,适用于小量DNA的提取;磁珠法植物基因组DNA试剂盒提取DNA,其浓度和纯度虽然略高于前者,但用时很长,比较适用于批量DNA的提取;Gene Pure新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA,其纯度高、但浓度低。【结论】烤后烟叶DNA的提取推荐使用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒。