马立克氏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以马立克氏病毒814株(MDV-814)作为免疫用抗原,建立了2个MDV特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株—4A6、3D7。鉴定结果表明;两株细胞所分泌的McAb均为IgM类免疫球蛋白,具有MDVⅠ型病毒特异性,无中和反应特性和沉淀反应特性。利用两种McAb对国内标准强毒MDV-京1株进行鉴定,肯定其为MDV-Ⅰ型毒株。     

鸡马立克氏病病毒(MDV)单克隆抗体(McAb)的研究——Ⅰ.抗血清Ⅰ型MDV-McAb的制备及其主要特性的研究

将MDV京-1株强毒高温致弱毒株(B-1/at)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物经冻融、超声波裂解和差速离心制成粗提高毒抗原,免疫6～8周龄雌性BALB/C小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,融合率为66％。用间接免疫荧光(IFA)法和间接ELISA法进行筛选,结果阳性率为25％,特异性阳性率为10.7％。通过有限稀释法克隆出D_(11)~3、D_(12)~3、和H_9~3三个分泌抗血清Ⅰ型MDV的McAb杂交瘤细胞株,其核内染色体数D_(11)~3为103±6条,D_(12)~3为96±6条,分泌的抗体均为IgG_1,k链。琼脂扩散试验(AGP)表明,无论有无聚乙二醇(PEG6000)存在,这些McAb均不产生特异性沉淀线,其IFA阳性反应能被特异性阳性血清阻断,经IFA、ELISA试验、IFA吸收试验和IFA、ELISA阻断试验等证明,这些McAb只与血清Ⅰ型MDV反应,不能与血清Ⅱ型MDV、血清Ⅲ型HVT和鸡的多种其它病毒发生交叉反应,也不与猪伪狂犬病病毒(Prv)双城株发生交叉反应,D_(12)~2株McAb有较明显的中和活性。经体内、外连续传代和冻存、复苏,两株细胞的分泌抗体能力稳定,     

马立克氏病病毒光敏生物素核酸探针的制备及应用

从马立克氏病病毒(MDV)GA株Bam HI基因文库中选取L片段,用光敏生物素标记该片段,制备了MDV光敏生物素核酸探针。其检测灵敏度达Pg水平,保存期至少4个月。对细胞培养物中病毒核酸的检测结果表明,探针只与血清Ⅰ型MDV DNA发生分子杂交,而不与血清Ⅱ型(SB-1)和血清Ⅲ型(HVT)MDV DNA发生反应。分别以京-1株(血清Ⅰ型)和Fc126株(血清Ⅲ型)接种1日龄雏鸡,于14日龄和30日龄采用斑点杂交法检测羽髓提取的病毒DNA,结果京-1株均为阳性,Fc126株均为阴性,表明该探针可以用于MDV强毒株和HVT疫苗毒株的区别诊断。采用斑点杂交法检测实验感染MDV GA株的鸡全部为阳性(16/16),检出率为100％;而用琼脂免疫扩散试验的检出率为87.5％(14/10)。试验表明,所制备的MDV光敏生物素核酸探针具有特异性强、灵敏度高、无放射性污染等优点。为MDV强毒株的临床检测及MDV分子生物学研究提供了一种重要手段。     

血清1型马立克氏病病毒单克隆抗体的制备及其特异性鉴定

为制备血清1型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）单克隆抗体,以超速离心浓缩的血清1型MDV CVI988/Rispens毒株免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过亚克隆、间接ELISA和间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay, IFA）筛选,获得3株分泌抗血清1型MDV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为4D9、1C5和1F10,并对其进行特异性分析。间接ELISA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水ELISA效价分别达5.1x104、8.2x105、4.1x105,可用于后续建立ELISA检测方法;IFA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水与不同血清1型MDV毒株具有良好的反应性,效价可分别达1: 12800、1: 25600和1: 12800,与血清3型MDV毒株和其他常见禽源病毒均没有交叉反应,特异性良好;亚型检测结果显示,4D9抗体为IgG2a/κ型,1C5抗体为IgG2b/κ型、1F10抗体为IgG1/κ型;应用1C5建立的IFA方法能检出至少5PFU CVI988/Rispens毒株感染,适用于血清1型MDV的检测。综上,制备的单克隆抗体可用于血清1型MDV的检测,为MDV致病机制研究及诊断试剂研发提供基础。     

马立克氏病病毒光敏生物素核酸探针的制备及应用

从马立克氏病病毒（MDV）GA株BamHI基因文库中选取L片段，用光敏生物素标记该片段，制备了MDV光敏生物素核酸探针，其检测灵敏度pg水平，保存期至少4个月，对细胞培养物中病毒核酸的检测结果表明，探针只与血清Ⅰ型MDV DNA发生分子杂交，而不与血清Ⅱ型（SB－1和血清Ⅲ型（HVT（MDV DNA发生反应，分别以京－1株（血清Ⅰ型）和Fc126株（血清Ⅲ型）按种1日龄急诊鸡，于14日龄和30日龄采用斑点杂交法检测须提取的病毒DNA，结果京－1株均为阳性，Fc126株均为阴性，表明该探针可以用于MDV强毒株和HVT疫苗毒株的区别诊断，采用斑点发校法检测实验感染MDV GA株的鸡全部为阳性（16／16），检出率为100％，而用琼脂免疫扩散试验的检出率为87．5％（14／16）。结果表明，所制备的MDV光敏生物素核酸探针具有特异性强、灵敏度高、无放射性污染等优点，为MDV强毒株的临床检测及MDV分子生物学研究提供了一种重要手段。     

鸡马立克氏病疫苗免疫机理及其发展概况

马立克病毒(MDV)属于疱疹病毒，有3个血清型。血清Ⅰ型(MDV-Ⅰ)，包括致病性的强毒株和非致病性的弱毒株。血清Ⅱ型和血清Ⅲ型(MDV-Ⅱ，MDV-Ⅲ)为非致瘤病毒，临床上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤的单性细胞浸润为特征。自20世纪70年代，多用抗MD的致弱血清Ⅰ株或HVT免疫鸡。1983年开始使用双价和多价疫苗，以保护鸡体抵抗毒力较强的MDV毒株。尽管疫苗免疫是相当有效的，但由于MDV毒力的不断增强，自20世纪90年代开始使用三价苗。     

母源抗体对某些致弱马立克氏病病毒株的影响

本文比较和评价了血清1、2和3型不同代次的马立克氏病病毒(MDV)株在有和没有这三种型母源抗体的鸡体内的中和敏感性。结果表明:1.分别接种 MDV 株,2周后,对有与没有三种血清型母源抗体的雏鸡进行比较。发现在前者的白细胞中,大部分毒株的分离率邰大大降低了。2.母源抗体刘血清1型低代次的 MDV 株比对其它两型毒株的中和作用小(JM/102w 例外)。3.在一定的代次范围内,母源抗体对1和2型 MDV 高代次毒株影响较大。而对3型毒株的影响较小。4.分离代次高的MDV 株,用直接鸡肾细胞培养并不比用鸡胚成纤维细胞从白细胞中分离病毒好。     

鸡马立克氏病的重组疫苗(综述)

本文论述了针对马立克氏病病毒(MDV)超强毒株(VVMDV)的新的预防方法。用禽痘病毒(FPV)和火鸡疱疹病毒(HVT)重组体来表达MDV抗原获得成功。研究发现,MDV血清Ⅰ型中的糖蛋白B(gB_1)是一种有效的免疫原,对具有遗传特征性的易感鸡群提供免疫保护显得尤为重要。然而,FPV—gB_1,重组体免疫效果可抗被MDV的母源抗体所减弱,构建表达MDV和新城疫病毒(NDV)抗原HVT重组体能有效抵抗马立克病和典型的新城疫病,抗MDV和NDV的母源抗体并不能显著地影响细胞介导的HVT重组疫苗的免疫效果。反转录病毒插入诱变以及表达MDV抗原产生免疫作用的其它方法在本文中一并讨论。 简介 八十年代以来,MDV超强病毒株(VVMDV)的出现促使HVT和MDV血清2型复合物或是HVT和致弱的MDV血清1型复合物联合用于WMDV预防接种。一些MDVⅠ型弱毒株如CVI998也被广泛使用。就MDV血清1型弱毒株而言,其在抗原性上几乎与病原株完全一致,因而从理论上讲比其它两型血清型应能更有效地诱发免疫应答。MDV血清Ⅰ型毒株通过系列传     

PCR法检测血清Ⅰ型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV1)A抗原基因(gA)部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应(PCR)的引物,分别对马立克氏病病毒血清Ⅰ型(京-1株,MD11/75C株);2型(SB-1株);3型(火鸡疱疹病毒的FC126株)毒株和G6A株BamHI B片段的PACY184克隆重组质粒DNA进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明,该引物不仅对MDV1具有较强的特异性,而且由此引物引导下的PCR可检测出1～10个质粒分子和1×10~6个细胞中的一个感染细胞。因此,我们推论,该法能适用于马克氏病(MD)临床病料和样本的检测。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 (MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B(g B)基因 ,通过 SDS- PAGE电泳分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过 EL ISA和间接免疫荧光试验 (IFA) ,得到 1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 EL ISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)均呈 IFA阳性。1∶ 10 0稀释时与 GA株感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 (dot- EL ISA)中呈阳性。     

马立克氏病病毒抗独特型单克隆抗体的研究

应用纯化的D_(11)~4株抗马立克氏病病毒（MDV）中和性单克隆抗体（McAb_1）,以SPA-IgG法和脂质体-IgG法制成免疫原,分别免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。以两步ELISA筛选法获得了3株抗独特型单克隆抗体（McAb_2）,分别命名为1B_8、10C_1和3D_5,其Ig亚类分别为IgG_1、IgG_1和IgG_(2b),染色体数在92～102之间。在捕获阻断ELISA中,McAb_2在1:20～1:80000稀释可不同程度地阻断MDV抗原与McAb_1的结合,阻断率为2.66％～76.40％。用纯化的McAb_2制成油佐剂苗,免疫20日龄雏鸡,经3次免疫后10d采取血清,可测得不同滴度的针对MDV抗原的抗体。这提示3株McAb_2的可变区构型和与McAb_1结合的MDV抗原决定簇或其邻近结构相似,有可能用于MD抗独特型疫苗的研究。     

马立克氏病病毒不同致病型meq基因的比较研究

为了研究马立克氏病病毒（MDV）的meq基因与不同毒株致病性的关系，应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因，测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括：国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、强毒GA株（vMDV)、特超强毒648A株（vv MDV)以及6个广西分离到的野毒株。结果发现，MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均在95.6%-99.7%。但是，与所有测试的致病性MDV毒株相比，二个Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和814株均在阅读框的核苷酸序列中缺失第575-577位3个碱基（CAC），导致一个氨基酸（脯氨酸）的缺失。该缺失性突变恰恰位于meq基因的多脯氨酸功能的一个重复序列（EELCAQLCSTPPPPI）之中。该缺失性突变与一个疫苗毒株失去致肿瘤性是否有关，还有待进一步研究。     

马立克氏病病毒囊膜粘蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB）基因，通过SDS－PAGE电泳分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过ELISA和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA株感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。     

鸡马立克氏病血清型

正所有的马立克氏病毒分离株可根据生物特性分为三个不同的血清型:1)血清1型:包括所有的致病性或致瘤性MDV及相应的致弱株。根据血清I型MDV诱发免疫鸡群MD病变的能力可将血清1型之MDV进一步分为:温和马立克氏病病毒(m MDV),强毒马立克氏病病毒(VMDV),超强马立克氏病病毒(VVMDV),超超强马立克氏病病毒     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B抗原Ⅰ型特异性和群共同性决定簇的单克隆抗体

用能表达马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）的重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞免疫小鼠，制备针对ＭＤＶｇＢ的单克隆抗体。以Ⅰ型马立克氏病病毒ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞作为检测抗原，同时以免疫荧光试验（ＩＦＡ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来筛选杂交瘤细胞，结果获得了ＩＦＡ和ＥＬＩＳＡ均为阳性的２株单克隆抗体细胞株，定名为ＢＡ４和ＢＤ８。在ＩＦＡ和免疫沉淀试验中，单抗ＢＤ８与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ＭＤＶ均呈阳性反应；单抗ＢＡ４只对Ⅰ型ＭＤＶ（包括ＣＶＩ９８８疫苗株）呈阳性反应。免疫沉淀反应进一步确证２株单抗识别的是ＭＤＶ糖蛋白Ｂ抗原。     

鸡马立克病病毒814株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析

从感染鸡马立克病病毒血清Ⅰ型(MDVⅠ)814株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取病毒总DNA,以其为模板,根据GenBank中MDVⅠ GA株基因组gE、gI、gp82基因序列,设计并合成3对特异性引物,用PCR方法分别扩增了814株的gE、gI、gp82基因,并将扩增的基因片段克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,应用DNA Star软件分析814株gE、gI、gp82基因核苷酸序列,并与已发表的MDVⅠ毒株序列进行了比较.结果表明,不同MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因同源性很高,814株与已发表的MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因核苷酸序列同源性分别在99.4%、98.9%和99.6%以上.     

用马立克氏病病毒强毒的BamH Ⅰ—L片段核酸鉴定血清1型毒株

马立克氏病病毒（MDV）GA强毒株的BamH Ⅰ-L片段DNA全长2892bp,G＋C此率为55．91％。用内切酶将其亚克隆为6个片段：BamHⅠ-PstⅠ,Pst-ClaⅠ-SmaⅠ,SmaⅠ-SmaⅠ和SmaⅠ-BamHⅠ。用地高辛标记L片段DNA或者分别标记其6个亚片段核酸,通过斑点要交试验都可将MDV血清Ⅰ型毒株与2型和3型的毒株区分开来,应用PCR方法可获得相同结果。但PCR方法更敏感、更快捷。结果表明,MDV GA强毒株的BamHⅠ-L片段DNA对MDV血清1型毒株是特异的。     

有效预防鸡马立克氏病

鸡马立克氏病(MD)是鸡的主要传染病,鸡群罹患该病使饲养者蒙受巨大的经济损失。该病的主要特征是淋巴细胞浸润和增长,在临床上表现为内脏型、神经型、眼型和皮肤型。MD病毒(MDV)属于B群疱疾病毒,具有很强的细胞结合特性,有三个血清型:MDV强毒及其致弱毒株为血清Ⅰ型;无致病力的自然无毒株为血清Ⅱ型;用作MD疫苗的火鸡疱疾病毒(HVT)则是该群疤疹病毒的血清Ⅲ型。1.疫病危害性马立克氏病毒传播途径多,危害严重。病鸡或阴性感染鸡可以长期带毒和排毒,它们的羽毛囊上皮细胞可复制具有感染力的完全病毒。这种完全病毒对外界有极强的抵抗力。病毒随皮屑和脱落的羽毛污染垫料、粪便、尘垢和空气等,并能在室温下存活4～6个月。病毒通过空气经呼吸道感染。健康鸡与病鸡直接接触,也能受到感染。在集约化、密集型饲养的地区,长年没有对该病采取有效地消毒和控制措施,则病毒在鸡群中不断地传代增强而形成超强毒,造成难以预防和控制的局面。     

马立克氏病疫苗研究进展

马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病,并以身体各组织发生单核细胞浸润进而最终形成肿瘤为特征。引起该病的致病因子,马立克氏病毒(Marek’s Deseas Virus,MDV)依据致病性和血清型反应差别,可分为三类,即MDVⅠ(强毒株及其致弱变异株)、MD     

鸡马立克氏病的流行与免疫

鸡马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒引起的鸡淋巴细胞增生性肿瘤疾病。其特点是在鸡外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤出现淋巴样细胞、单核细胞的浸润和增生及肿瘤的形成。鸡马立克氏病病毒（MDV）归属于疱疹病毒科。MDV在流行过程中经常出现变异毒株，其共同特点是毒力比一般毒株强，有极强的肿瘤性，用HVT免疫的鸡不能阻止其致瘤性。MDV分3个型，Ⅰ型为致病性强毒株及其致弱毒株，Ⅱ型为无致病性的自然弱毒株，Ⅲ型为火鸡疱疹病毒（HVT），此型病毒本非MDV，但因与鸡马立克氏病关系密切，故将其划分在马立克氏病毒型内。