生物工程应用于作物育种的试验甘蔗抗黑穗病细胞突变体的筛选

本试验采用甘蔗愈伤组织作离体培养，在培养基中加入甘蔗黑穗病粗毒素滤液为选择压力。采用电导率、生长量、蛋白质含量作为选择抗病性突变体的一种技术方法加以研究。实验表明：粗毒素滤液具有与黑穗病孢子相同的致病性，可替代孢子用于甘蔗抗黑穗病突变体的筛选与鉴定。测定甘蔗愈伤组织受侵染后的生长量和愈伤组织的电导率，可作为选择抗病突变体鉴别方法之一。     

菜心耐羟脯氨酸变异筛选方法的研究

研究了菜心种子、茎尖和愈伤组织离体筛选耐羟脯氨酸变异的方法。在多代连续选择中0．3mg／mL的羟脯氨酸对茎尖和愈伤组织是一个适宜的选择压力,经3～4个周期筛选后可获稳定人选株。种子萌发后的幼苗在1．0mg／mL浓度上经4个世代连续筛选可获抗性株系。3mg／mL浓度可用于幼苗的前期淘汰。人选系耐羟脯氨酸的能力和耐热性提高。     

水稻成熟胚愈伤组织耐盐变异体的筛选

在培养基中加入一定浓度的Nacl,对水稻F_2代成熟胚愈伤组织的耐盐突变体进行细胞水平上的筛选，采用逐渐加盐浓度多次继代筛选法。结果表明：此方法是提高耐盐变异体频率的有效措施。诱导愈伤组织Na十Nacl0．3％继代3次的愈伤组织→Ms分化频率达15．74％，获得了在0.3％含盐土壤上种植能正常生长的耐盐株系四个。     

水稻愈伤组织增殖力的遗传研究

考察了高愈伤组织增殖力的粳稻品种Aikoku和低愈伤组织增殖力品种Moritawase、Norin 1杂交组合的双亲和正反交F1、F2、F3的愈伤组织增殖力。正反交F1呈现大而淡黄、与Aikoku相似的高愈伤组织增殖力类型，而Moritawase和Norin1呈现小而褐色的低愈伤组织增殖力类型。F2中，高、低愈伤组织增殖力类型的个体符合13：3的比例．F1世代，高愈伤组织增殖力株系、愈伤组织增殖力分离的株系及低愈伤组织增殖力的株系符合7：8：1的比例。3个世代的分析结果一致表明，Aikoku所具有的高愈伤组织增殖力由相互独立的1对显性和1对隐性基因支配，不受细胞质的影响。研究结果还表明愈伤组织增殖力和再生力由不同的基因控制。本研究中使用的愈伤组织诱导培养基是1／2 MS 3mg／L2，4-D 5g／L酵母粉 30以蔗糖 11g／L琼脂。     

玉米耐低磷细胞的筛选及再生植株后代的研究

以玉米自交系齐319、掖515和掖502为材料,取其幼胚诱导胚性愈伤组织并继代培养.将继代培养半年左右的胚性愈伤组织转移到去掉磷酸盐的培养基上进行筛选.在连续筛选5代后,挑出生长较好的胚性愈伤组织进行分化.再生植株移栽成活后自交结实,子一代通过砂培进行低磷胁迫处理,观测植株生长状况、缺磷症状出现的时间及植株移栽后的成活率.初步结果表明,再生植株后代中有21%的株系与对照相比表现出耐低磷特性;在同一株系内,不同个体在耐低磷特性上有一定差异.     

基因枪法导入Bar基因转化小麦幼胚的研究——抗性愈伤组织与再生植株的遗传转化

在前文研究基础上 ,轰击的 2 80 4个幼胚经 L - PPT筛选后共获得 2 5 9个抗性愈伤 ,对其中 2 0 0个抗性愈伤组织和再生的 32个植株 GU S gene的表达进行组织化学检测 ,以及再生植株的 PCR检测。研究结果表明 ,有 4 5个抗性愈伤组织呈 GUS阳性。32株再生植株中获得 4个抗性株系 ,经 X- Gluc染色 ,在花药中检测到 GU S基因表达 ,PCR检测也呈阳性 ,而在对照和其它再生植株中未发现 GU S和 BAR基因表达     

运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体Ⅱ 抗毒素愈伤组织的再生植株及其后代的抗病性鉴定

用黑胫病粗毒素作为选择压力, 结合辐射诱变技术, 从烟草花粉植株叶片的愈伤组织中筛选出抗毒素的愈伤组织, 并对其再生植株及其 Ｍ２ 代进行抗病性鉴定、选育． 目前已获得６ 个高抗黑胫病的细胞突变株系, 且抗病性状表现稳定, 并建立了一套烤烟抗黑胫病突变体的筛选和鉴定体系． 研究结果表明, 在细胞水平上筛选抗病突变体是开发新抗源的有效途径．     

病原毒素诱导水稻抗稻瘟病突变体初探

以稻瘟病病原毒素滤液为选择压力，在水稻种胚愈伤组织的诱导，继代，分化过程中筛选水稻抗稻瘟病突变体。不同品处的种胚，不同激素和附成成分配比的培养基，对稻胚愈伤组织诱导率差异明显。以较低浓度毒素诱变，可获得较多绿苗，但诱变效果较差；较高的毒素浓度，获绿苗较少，但诱变效果较好；过高的毒素浓度可对策，变结果共获７个中抗稻病的株系。     

绿稻的花药培养

使用三步培养法对粳绿稻品系810104系进行花药培养.以N6+2,4-D 1.0mg/L+NAA 3.0mg/L+KT 1.0mg/L+椰乳100mL/L+麦芽糖50g/L+Na2SiO3 60mg/L+琼脂粉7g/L(pH5.8)作为愈伤组织诱导培养基,MS+BA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L(pH5.8)作为分化培养基.愈伤组织诱导率为3.33%,绿苗分化率为11.49%.获得绿色花培再生植株18丛,分为39个单株系.经田间形态观察和染色体计数鉴定,其中有33个株系为单倍体,6个株系为二倍体.6个二倍体株系中,有2个株系的粒色表现为纯合体,有4个株系的粒色表现为杂合体.4个杂合体株系中,有一个显现出花叶性状.对花药培养过程中的形态变化观察结果表明,在三步培养法中,愈伤组织分化形成胚状体和不定芽,其中以形成胚状体为主;在愈伤组织直径约为1mm时转入分化培养基为佳.     

小麦体细胞无性系的建立及抗赤霉病突变体的诱导

利用小麦鄂恩１号和Ｋ６两个品种的胚轴、胚芽鞘作外植体建立了体细胞无性系，获得了可用于突变体诱导与筛选的胚性愈伤组织细胞。结果表明，不同基因型和不同外植体在愈伤组织诱导率、愈伤组织生长状态以及愈伤组织分化上均有差异，且均匀激素的调控。赤霉菌粗毒素处理后，胚性愈伤组织在培养过程中随毒素浓度升高其生长受抑加剧，褐变增加，有的出现死亡。诱变后的愈伤组织的分化力比对照降低。诱变的再生植株经赤霉菌液感染后在培     

运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体 Ⅱ 抗毒素愈伤组织的再生植株及其后代的抗病性鉴定

 用黑胫病粗毒素作为选择压力,结合辐射诱变技术,从烟草花粉植株叶片的愈伤组织中筛选出抗毒素的愈伤组织,并对其再生植株及其M₂代进行抗病性鉴定、选育。目前已获得6个高抗黑胫病的细胞突变株系,且抗病性状表现稳定,并建立了一套烤烟抗黑胫病突变体的筛选和鉴定体系。研究结果表明,在细胞水平上筛选抗病突变体是开发新抗源的有效途径。     

普通小麦抗赤霉变异细胞系的离体筛选及其再生系抗性分析

通过禾谷镰刀菌毒素胁迫下的幼胚直接筛选、愈伤组织筛选、一步筛选和多步筛选相结合的方法, 从普通小麦千斤早和小偃22中筛选出了抗镰刀菌毒素变异细胞系,比较分析了不同筛选方法在不同筛选程序上的筛选效果,研究了再生株系R0代的抗赤霉特性。结果表明,利用毒素胁迫对优良品种进行抗赤霉细胞工程定向改良是有效可行的,可获得抗病性显著提高的变异株系;利用幼胚直接多步筛选,在高毒素质量浓度上获得抗性植株的比例和抗性提高的幅度均较从愈伤组织筛选和低毒素质量浓度上获得的效果更好。     

矮牵牛细胞的长期离体培养及再生植株的ISSR分析

 【目的】实现矮牵牛细胞的长期离体培养和再生，不但可以获得矮牵牛体细胞突变体，从中选出优良株系，而且可以为研究外源基因在矮牵牛细胞增殖与分化过程中的稳定性提供技术体系。【方法】以重瓣矮牵牛叶片为外植体，使用不同浓度BA与NAA的组合在黑暗条件下诱导愈伤组织。在不同光条件下，将愈伤组织在MS+ BA 2.0 mg•L-1+0.5 mg•L-1 NAA+200 mg•L-1 CH 与 MS+ BA 0.5 mg•L-1+0.5 mg•L-1 NAA+200 mg•L-1 CH两种培养基进行愈伤组织3年多的继代培养，并利用筛选的8个引物对20个再生植株的总DNA进行ISSR分析。【结果】不同的生长素与分裂素配比诱导的愈伤组织状态明显不同，继代后的愈伤组织在低激素培养基上分化出不定芽，再生芽复壮后可得到正常植株。对再生植株的总DNA进行ISSR分析发现，再生植株之间存在很大的遗传变异。【结论】矮牵牛愈伤组织在高BA浓度培养基上可长期继代保存；在低激素培养基上可实现植株再生。长期离体培养矮牵牛是获得其突变体的有效方法。     

不同筛选剂对大豆原生质体愈伤组织生长的影响

利用低温、低氮、低磷、低钾及各种氨基酸类似物等筛选剂对大豆原生质体愈伤组织进行筛选，以探索大豆原生质体对筛选因子的敏感性。结果表明：（1）愈伤组织对低温十分敏感；（2）愈伤组织对低氮、低磷、低钾敏感性不一．（3）愈伤组织对各种氨基酸类似物的敏感性不一，基本趋势是随着浓度的升高愈伤组织的鲜重、成活率下降。     

番茄耐盐愈伤组织的筛选及显微结构观察

以番茄下胚轴为外植体诱导愈伤组织，转入含10g/LNaCl的筛选培养基上培养，经过3代高盐直接筛选，获得耐盐愈伤组织，进行电镜观察，结果表明，存活下来的耐盐绿色愈伤组织细胞及细胞器（与对照相比）形态结构正常，代谢活动旺盛，而处于死亡状态的浅褐色愈伤组织和解体死亡的黑色愈伤组织细胞及细胞器形态结构异常。     

植物高渗转基因新技术的初步建立

以番茄愈伤组织和水稻愈伤组织为转化受体,以pBG和pB1121为外源DNA,以蔗糖和甘露醇为渗透剂,对植物高渗转基因技术进行了研究．结果表明：高渗转化后愈伤组织GUS基因瞬问表达率为38．9％,经抗性筛选,获得番茄和水稻Basta抗性愈伤组织,番茄Basta抗性愈伤组织经分化培养后,共得到29个Basta抗性芽,证明植物高渗转基因技术得到初步建立。     

高效农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立

以农艺性状优良的紫花苜蓿品种“德宝”为转化受体,通过对外植体选择、bialaphos筛选浓度、预培养与共培养时间等因素进行优化,成功建立了高效苜蓿组织培养再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系。试验结果表明,子叶作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达97%;bialaphos作为筛选标记,获得转化愈伤组织与转基因植株的最佳筛选浓度为2.5 mg/L;子叶在农杆菌浸染前的预培养对于对于抗性愈伤组织产生频率甚为关键,可由低于5%(未经过预培养)提高至30%以上(预培养3 d);子叶与农杆菌的共培养时间以3 d为最佳。按最佳条件转化共计获得100余株T0代抗性株系。PCR检测其中30个抗性株系,全部表现为阳性。对抗性植株和野生型植株叶片喷施5‰除草剂Basta溶液,阳性植株全部表现为除草剂抗性,进一步证实了建立的紫花苜蓿转化体系是高效、可靠的。     

低温胁迫筛选苜蓿抗寒突变体细胞

以准格尔苜蓿茎段诱导愈伤组织，对愈伤组织进行低温筛选，获得抗寒性突变体，并用生理生化方法对突变的愈伤组织体细胞的抗寒性进行了鉴定，为抗寒育种提供原始材料。     

共转化获得无抗性标记的转反义蜡质基因籼稻

【目的】利用转基因技术将反义蜡质基因导入籼稻成熟胚愈伤组织中,改良籼稻稻米直链淀粉含量。【方法】用根癌农杆菌介导的方法将p13W8质粒（含反义蜡质基因）和pCAMBIA1300质粒（含抗潮霉素抗性基因）对2个籼稻品种的成熟胚愈伤组织进行遗传共转化。【结果】供试材料愈伤组织继代培养18～24 d后具有较高的转化频率和分化频率,可作为共转化的良好受体;抗性愈伤组织PCR检测结果表明,抗潮霉素抗性基因的阳性检测率为97.6%,反义蜡质基因的阳性检测率为27.1%。在46株转基因潮霉素抗性植株中,反义蜡质基因阳性株为5株,占转基因植株的10.9%。经PCR检测,发现上述4个株系T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因片段的分离,从286个T1单株中筛选到了39个单株只带反义蜡质基因片段,而无潮霉素抗性基因的转基因植株,占T1单株总数的13.6%。部分转反义蜡质基因植株种子的直链淀粉含量有不同程度的降低。【结论】通过农杆菌介导的遗传共转化方法,将反义蜡质基因Waxy导入籼稻成熟胚愈伤组织,获得了直链淀粉含量明显降低的仅含反义蜡质基因籼稻株系。     

盐胁迫水稻愈伤组织的生理生化指标检测

对水稻幼穗外植体诱导产生的愈伤组织进行盐胁迫筛选后,经对连续继代３～４次的愈伤组织生理生化指标检测,结果表明：在一定盐浓度下,水稻愈伤组织会产生积极的防御反应,通过积累脯氨酸、增强酶活性和表达新的同工酶来适应盐胁迫环境。一系列生理生化变化为水稻抗盐愈伤组织筛选提供了参考指标。