延边白鹅γ干扰素基因的克隆及序列分析

为了研究延边白鹅γ干扰素的生物学特性,本试验采用刀豆素（ConA）刺激延边白鹅外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法扩增鹅γ干扰素基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列和序列分析。结果显示,延边白鹅γ干扰素基因全长495bp,经序列比对发现,克隆到的延边γ白鹅干扰素基因（JX966250）与哈尔滨鹅γ干扰素基因（AY524421）核苷酸序列同源性高达100%,与广东狮头鹅（EU030377）核苷酸序列同源性达99.6%,而三者的氨基酸同源性为100%。本试验成功克隆到延边白鹅γ干扰素基因,为进一步研究鹅干扰素的分子生物学特性和抗病毒作用机理奠定了基础。     

巴马小型猪主要细胞因子的克隆及序列分析

为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。     

猪IFN-α1和IFN-β1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。     

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

水貂α-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据GenBank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂α干扰素（IFN-α）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT-PCR扩增水貂α干扰素基因,获得了约564bp片段,将其克隆到pEasy-T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂α干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的水貂的IFN-α基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为94.3%～95.5%,氨基酸序列同源性为89.3%～91.4%。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在78.1%～99.3%之间和69.4%～100.0%之间。     

乌鬃鹅a干扰素基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从乌鬃鹅肝脏中扩增a干扰素（Interferon,IFN-a）基因片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用生物信息学软件Lasergene v7．1DNAStar和在线分析方法对IFN—a基因的核苷酸序列及其氨基酸序列进行了生物信息学分析,同时与GenBank中登录的鸡、鸭和鹅IFN．仅基因核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明,所扩增的IFN—a基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576bp,与鸡、鸭与鹅IFN-a基因核苷酸序列同源性在72．0％～99．7％,遗传进化树显示鸡、鸭、鹅IFN-a因在遗传进化上各处一支。乌鬃鹅IFN-a基因的克隆及生物信息学分析为进一步研究鹅干扰素抗病毒的作用机理奠定基础。     

华南虎和东北虎β-干扰素基因的克隆与遗传进化分析

采集新鲜东北虎与华南虎的血液,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增β-干扰素(IFN-β)基因,克隆到p MD19-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,进行菌液PCR鉴定,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,所克隆到的老虎IFN-β基因全长561 bp,编码187个氨基酸,核苷酸序列同源性为99.3%~99.5%。同时将核苷酸序列与其他几种哺乳动物进行遗传进化分析,其同源性在60.8%~98.4%。东北虎和华南虎及其他8种动物的IFN-β基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-β基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高;老虎IFN-β基因的成功克隆,为进一步研究猫科动物IFN-β基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

梅花鹿α干扰素全基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank中牛干扰素-α(IFN-α)基因序列(A00145),设计并合成了一对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-α全基因,并克隆、测序。结果表明,梅花鹿IFN-α基因全长570bp,编码189个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸;序列比较分析发现,梅花鹿IFN-α基因序列与GenBank发表的17种IFN-α基因核苷酸序列同源性为29.6%～93.7%,氨基酸序列同源性为18.4%～91.1%;梅花鹿与其他17种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-α基因存在种属特异性,亲缘关系越近,同源性越高。梅花鹿INF-α基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-α基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

水貂干扰素-β基因的克隆与序列分析

采集新鲜水貂肝脏组织,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增水貂IFN-β基因,克隆到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,经PCR和EcoRⅠ及SalⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆.核苷酸序列分析证实,所克隆到的水貂IFN-β基因全长56lbp,编码186个氨基酸,核甘酸序列同源性为100%.与GneBnak上已公布的人类的INF-β基因序列同源性为34.06%,与鼠的同源性为37.60%,与犬的同源性为99.15%,与鼬的同源性为99.64%.     

藏羊IFN-γ基因的扩增、序列分析及蛋白结构预测

为了研究藏羊IFN-γ基因的功能,提取藏羊脾脏总RNA,通过RT-PCR扩增藏羊IFN-γ基因并测序,应用DNA Star软件进行序列分析及编码蛋白结构预测。结果表明,藏羊IFN-γ基因长度为429bp,其中腺嘌呤和胸腺嘧啶含量较高,该基因编码143个氨基酸,其中疏水性氨基酸和亲水性氨基酸的含量较高。藏羊IFN-γ基因与参考绵羊、山羊、藏羚羊和牛IFN-γ基因的核苷酸序列同源性依次为100%、99.3%、99.1%和97.2%,氨基酸序列同源性依次为100%、99.3%、99.3%和95.8%。IFN-γ蛋白主要由α螺旋组成,亲水性较高,含有5种蛋白质功能位点,分别为1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酰胺化位点、2个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点和3个蛋白激酶C磷酸化位点。     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。     

民猪IFN-γ基因的克隆及序列分析

为了获得民猪干扰素-γ(IFN-γ)基因,并对该基因进行序列分析,试验采用RT-PCR技术,根据猪IFN-γ基因设计1对引物,从刀豆素A(ConA)活化的民猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,获得了长度为502 bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明:民猪IFN-γcDNA长度为502 bp,IFN-γ基因的开放阅读框大小为501 bp,编码166个氨基酸,含有2个潜在N-糖基化位点;民猪IFN-γ基因与藏猪、贵州白香猪、成华猪和梅山猪等的同源性为100%。     

茶花鸡2号IFN-α基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆茶花鸡2号α干扰素基因（IFN-α）CDS区序列并进行生物信息学分析,为后续研究IFN-α基因对茶花鸡2号免疫功能的影响提供参考。以茶花鸡2号为实验对象设计IFN-α引物,提取总RNA,反转录PCR扩增并克隆其编码区序列,进行生物信息学分析。结果显示茶花鸡2号IFN-α基因CDS序列全长582 bp,IFN-α蛋白等电点5.05,平均疏水指数-0.514,为酸性亲水蛋白,且存在信号肽和1个跨膜区,主要定位于细胞核。IFN-α蛋白被4个N糖基化位点、5个O糖基化位点和20个磷酸化位点修饰,主要由α-螺旋与无规卷曲构成。茶花鸡2号与固始鸡、海兰鸡、惠阳胡须鸡、罗曼鸡和乌骨鸡的氨基酸同源性分别为95.9%、97.9%、97.9%、97.9%和95.9%。IFN-α蛋白与IRF7、IFNAR1、IFNAR2和IFNK等蛋白存在互作关系。本研究结果可为进一步探讨IFN-α基因在茶花鸡2号病毒疾病防治中的作用提供理论依据。     

鹅IGF-I基因cDNA的克隆、分析与原核表达

从GenBank中读取鸡、鸭、鹌鹑、火鸡等的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因序列进行分析并设计引物,运用RT-PCR法从五龙鹅的总RNA中克隆了IGF-I基因的完整编码区序列(GenBank登录号为DQ662932).运用生物信息学技术对序列进行分析,结果显示:五龙鹅JGF-I基因的编码区长462 bp,与鸭和鸡基因序列同源性分别为99.6%和98.1%;分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸭、鸡及其他动物的进化关系;同源建模分析发现该基因有3个α-螺旋组成.克隆鹅IGF-I基因表达序列,然后连接到pET-32a载体上进行原核表达.经SDS-PAGE分析发现原核表达产物约为28 ku的融合蛋白,Western杂交分析表明,重组蛋白为目的蛋白.     

长白猪γ-干扰素基因的克隆与序列分析

将长白猪外周血淋巴细胞进行体外培养,在ConA的刺激下培养8h～24h后,提取培养的淋巴细胞的总RNA,应用RTPCR技术扩增淋巴细胞γ干扰素cDNA,并将其克隆到pGEMT载体上,进行测序。序列测定结果表明,克隆获得的IFNγ基因全长为534个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸,分子质量为19.4ku。此基因与我国藏猪、成华猪以及GenBank上发表的猪IFNγ基因的核苷酸同源性均为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。说明几种我国地方猪IFNγ在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变,同时也证实了长白猪干扰素γ基因的正确、完整克隆。     

鸡α-干扰素基因的克隆与原核表达

根据Genbank中发表鸡α-干扰素基因序列设计一对引物,采用PCR法从SPF鸡的全血白细胞中克隆了α-干扰素基因(ChIFN-α)。序列分析结果显示,与已发表的ChIFN-α的同源性在98.1%以上,与其他禽类的IFN-α同源性在67.4%以上,其中与火鸡IFN-α同源性在89.8%,而与鸭α干扰素同源性仅为67.4%。将该基因连接到原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒,转入BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE分析,可见一条约19ku的清晰蛋白带,结果表明克隆的ChIFN-α基因在原核中获得表达。     

鸡α干扰素基因的克隆和鉴定

采用反转录-聚合酶链反应技术，从传染性囊病病毒感染的鸡胚成纤维细胞中扩增出石岐杂鸡的α干扰素（spzChIFN-α)基因，将包括sqzChIFN-α编码区的cDNA片断克隆到pBssK载体中，并对该片断进行序列测定，核苷酸序列测定结果表明克隆的ChIFN-α基因cDNA片段长度为724bp，和其他ChIFN-α基因的同源性在9左.1%以上，与其它α食干扰素基因的同源性在67.4%以上，其中与鸭α干扰素基因的同源性为67.4%，与火鸡α干扰素基因的同源性为89.8%，推导的石岐杂鸡α干扰素氨基酸序列与其它禽类的α干扰素的同源性在49.2%以上，其中与白来航鸡α干扰素的同源性为96.9%-99%，与鸭和火鸡α干扰素同源性分别为49.2%和80.7%。     

金堂黑山羊IFN-γ基因克隆与组织表达分析

为了解γ干扰素(IFN-γ)基因在金堂黑山羊体内的表达情况,采用RT-PCR法克隆金堂黑山羊IFN-γ基因,用ExPASy网站对其蛋白质结构进行生物信息学分析,并构建系统发育进化树,最后采用荧光定量PCR法检测了IFN-γ基因在健康金堂黑山羊5个组织器官中的表达情况。结果表明:金堂黑山羊IFN-γ基因长580 bp,蛋白质编码区(CDS区)为519 bp,共编码172个氨基酸,氨基酸序列有13个磷酸化位点,在第39位和第106位有2个糖基化位点,三级结构以α-螺旋为主,中间均匀夹杂着无规则卷曲,金堂黑山羊IFN-γ是一种带正电荷的不稳定的亲水性蛋白质;金堂黑山羊与山羊、绵羊、野水牛IFN-γ基因的开放阅读框(ORF)序列同源性均为98%;实时荧光定量PCR检测到IFN-γ在健康金堂黑山羊各组织器官中表达量不同,在脾脏中的相对表达量最高,在心脏和肌肉中几乎没有表达。说明IFN-γ基因较为保守,可能参与山羊的免疫应答反应。     

日本大耳白兔干扰素-γ基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

提取经ConA 刺激后的日本大耳白兔外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术对其IFN-γ基因进行扩增和测序。将去除信号肽的IFN-γ基因片段插入原核表达载体pET-30a并在大肠杆菌中进行表达。结果显示,克隆的IFN-γ基因长为504个核苷酸,具有一个完整的开放阅读框,编码168个氨基酸,所测序列与GenBank中已登录的安哥拉兔、中国白兔、欧洲兔、新西兰兔IFN-γ同源性为100%,与獭兔同源性高达99.8%。构建的重组菌经过IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳证实,IFN-γ基因片段在大肠杆菌中得到了融合表达,分子质量约为18 ku,表达量为菌体总蛋白的35%左右。以上结果为下一阶段兔IFN-γ重组蛋白生物学特性及其应用的研究奠定了基础。